2013 Fiscal Year Research-status Report
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25840025
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Ritsumeikan University |
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Principal Investigator |
北原 亮 立命館大学, 薬学部, 准教授 (70512284)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | TDP-43 / RRM / OspA / pressure / NMR |
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| Research Abstract |
本課題では、筋萎縮性側索硬化症ASLに関わるTDP-43蛋白質及びライム病関わるOspA蛋白質について、それらの変性中間体の構造と物性解明を目的としている。これまでの高圧力NMR法を用いた構造揺らぎ研究から、TDP-43の異常凝集に強く関わるRNA結合ドメイン(RMM1)について、一部の領域の構造が壊れミスフォールドした状態が観測され、二量体及びオリゴマー、アグリゲーション形成過程のトリガーとなると考えられる(Shodai et al. JBC 2013)。またOspAについては、250アミノ酸残基中、中央からC末端側の約150残基が変性状態に転移した変性中間体の存在を確認しており、感染に際しホストとなるダニの腸管に存在するレセプター認識に役に立つコンフォメーションと考えている(Kitahara et al. Biophysical J. 2012)。
本年度、RRM1について原子間力顕微鏡(AFM)を用いた凝集体の解析を行った。AFM解析により、圧力処理及び温度処理による時間経過とともに顆粒状の凝集物が観測された。画像に基づく高さ解析により、一定の高さをもつ凝集物が観測された。また針状の線維状凝集物も観測された。同時に行ったSDSページ解析から、凝集物は単量体及び、SS結合による二量体を主として形成されていることがわかった。RRM1のミスフォールドから生じる凝集体形成過程が徐々に解明されつつある。また天然物や化合物による凝集阻害効果を検証するため、TDP-43全長の遺伝子を作成し、発現及び精製手法を確立した。
またOspAについては、25kDaという分子量の問題があり、多重標識した蛋白質試料が必要となる。無細胞システムを用いて、15N, 13C, 2Hを標識した試料作成を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
RRM1は、圧力や温度など外部摂動により、ミスフォールド状態からSS結合を介した２量体を形成する。本年度、構造解析を目的として２量体を分離精製するところまで到達する予定であったが、同時並行して行っている凝集阻害評価系の構築や全長TDP-43の発現システムの構築に時間を費やした。
OspAについては、無細胞システムによる多重標識試料の発現量が低く、NMR測定に必要な十分量が得られなかった。重水を用いた発現法など他の手法を試みる必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
TDP-43の凝集阻害から、最終目的のALSの進行阻害効果のある化合物の発見に結びつける必要がある。RRM1のみならず全長TDP-43での評価も必要となるため、RNA相互作用や凝集に関わる評価系の構築を行う。また共同研究等により立体構造情報を用いたインシリコスクリーニングも行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
13C, 15N, 2Hの安定同位体標識に多くの予算を割く必要が生じた。一方で予備のセラミクス製耐圧NMRセルを約170万円で購入を予定していたが購入を見送った。既に所有しているため研究遂行に問題は生じていない。それらの差額として未使用額が発生した。
13C, 15N, 2Hの安定同位体標識試料を十分量作成するために、2-3リットルレベルの重水素、13Cグルコースなど安定同位体標識試薬の購入に使用する。またNMR装置維持のために液体ヘリウムを購入する。
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[Journal Article] Aberrant assembly of RNA-recognition motif 1 links to pathogenic conversion of TAR DNA-binding protein-43 (TDP-43)2013
Author(s)
Akemi Shodai, Toshifumi Morimura, Akemi Ido, Tsukasa Uchida, Takashi Ayaki, Rina Takahashi, Soichiro Kitazawa, Sakura Suzuki, Mikako Shirouzu, Takanori Kigawa, Yutaka Muto, Shigeyuki Yokoyama, Ryosuke Takahashi, Ryo Kitahara, Hidefumi Ito, Noriko Fujiwara, and Makoto Urushitani
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Journal Title
J. Biol. Chem.
Volume: 288
Pages: 14886-14905
DOI
Peer Reviewed
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