質量分析法を用いたリボソーム複合体のsemi-in vivo溶液構造解析

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25840052
• Research Institution: Suntory Foundation for Life Sciences
• Principal Investigator: 山本 竜也 公益財団法人サントリー生命科学財団, その他部局等, 研究員 (70437573)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: リボソーム / 構造機能相関

Outline of Annual Research Achievements

細胞内の巨大複合体構造分子について、その構造ダイナミクスを検出・解析することで生体内での機能解析を推し進めていくために、質量分析とH/D交換を用いた分析法の開発及びその利用による生命現象の解明を目指している。中でも本研究課題では他の溶液構造解析では困難とされている分子量が2MDaを超える巨大なリボソーム複合体について50個を超える様々なタンパク質の重水素取り込み速度を一斉検出することで動的構造変化を解析する研究を進めてきた。H25年度は大腸菌の菌体から直接リボソームの情報を取りだし、55あるタンパク質のうち45個についてダイナミクスの情報を得る系を確立した。26年度ではフシジン酸等を用いた大腸菌リボソームの構造の動きを止める阻害実験を進めながら、HEK293細胞を用いたヒト由来リボソーム検出系に着手した。最終年度の27年度では本研究課題での最大の目標である高等動物由来のリボソーム構造変化を検出することを目指し、様々な実験を行った。HEK293ヒト由来の細胞のリボソームをターゲットとし、細胞に直接レーザー脱離イオン化を行うなど試みたが、最終的には抽出液を用いることでS/N比の向上を果たした。また、より生体内に近いリボソーム構造の情報を得るために、比較的弱い超音波を使った細胞破砕液をそのままH/D交換に使ったが、粗精製を行えばよりS/N比の高い情報が取れることも分かった。直接破砕液で34のピークがリボソームタンパク質の質量と一致し、ヒト由来のリボソームについて世界で初めて動的な構造変化を一斉検出可能になった。今回開発した手法は更なる分析前処理の改良により、粗精製画分を用いた阻害実験・相互作用実験などを通じて、これまで困難とされてきた構造解析から巨大複合体の生命現象を解明する道が開かれた。