2013 Fiscal Year Research-status Report
動的構造解析によるOct3/4の多様なDNA配列認識機構の解明
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25840059
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Suntory Foundation for Life Sciences |
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Principal Investigator |
小沼 剛 公益財団法人サントリー生命科学財団, その他部局等, 研究員 (10631682)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | NMR / 蛋白質の精製 / 溶媒のpH |
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| Research Abstract |
本研究プロジェクトは、転写因子Oct3/4のDNA認識機構を原子分解能で解析することで、Oct3/4による転写ネットワークの制御システムの解明を目的としている。本研究では、Oct3/4の動的な構造解析を行うため、主に核磁気共鳴法（NMR）を利用する。そこで、すでに先行研究で確立されている大腸菌の発現系を利用し、15N標識したOct3/4の大量発現を行った。続いて、発現したOct3/4をニッケルキレート樹脂を用いて精製を行い、純度の高い蛋白質溶液を得た。しかしながら、この溶液をNMR測定用の溶媒（pH 7.0, 150 mM NaCl）で透析したところ、Oct3/4の凝集が確認された。蛋白質が凝集してしまうと、NMR測定だけでなく、今後全ての実験が困難となる。そこで、Oct3/4が凝集しない溶媒条件の検討を行った。まずpHを6.0および5.0まで下げた。pH 6.0ではほぼ凝集は改善されなかったが、pH 5.0ではわずかに凝集が減少した。またpH 7.0のまま、凝集抑制剤で知られるアルギニンを500 mMになるように蛋白質溶液に加えてみたところ、ほぼ凝集が抑制された。今後、この溶媒条件でNMR測定を行い、Oct3/4のスペクトルを確認することで、その溶媒条件で今後の実験計画が遂行可能か判断する。また溶媒のpHを変化させ、また、塩を加えることで可能な限りアルギニン濃度を減らし、より良い溶媒条件を探索する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初計画していた中性付近の溶媒条件下で、Oct3/4が凝集してしまった。そのため、NMR測定を行うことができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
Oct3/4が凝集しない、かつ、今後の実験計画を遂行できる溶媒条件を探索する。具体的には、溶媒のpHを変化させる、塩やアルギニン以外の凝集抑制剤を加えることが考えられる。適切な溶媒条件の決定後、NMRスペクトルのシグナル帰属および動的構造解析を行う。
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[Journal Article] Solution structure of the ubiquitin-associated (UBA) domain of human autophagy receptor NBR1 and its interaction with ubiquitin and polyubiquitin2014
Author(s)
Erik, W., Morimoto, D., Sugase, K., Konuma, T., Tochio, H., Shirakawa, M.
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Journal Title
J. Biol. Chem.
Volume: -
Pages: -
Peer Reviewed
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