2014 Fiscal Year Research-status Report
双方向のＮｏｔｃｈ－Ｄｅｌｔａシグナルによる組織発生制御機構の解明
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25840096
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
大久保 佑亮 国立医薬品食品衛生研究所, 毒性部, 主任研究官 (80596247)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | Notchシグナル / Deltaシグナル / 神経発生 / 体節形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Notch-DeltaシグナルはリガンドDeltaと受容体Notchが細胞間で結合することにより、Notchの細胞内領域が切り出され核に移行し転写を制御する一方向性のシグナル伝達とされている。この時Deltaの細胞内領域(DICD)もNotch同様に切り出され核に移行することが知られているが、その生理機能は明らかになっていない。本研究では、異なるNotch-Deltaシグナルの制御を受ける神経形成と体節形成を対象として、Deltaシグナルの生理作用を明らかにすると共にNotch-Deltaシグナルを両面から解析することで、これまで隠れていた双方向性のNotch-Deltaシグナルによる組織発生の制御機構を導き出す。
神経発生：DICDを過剰発現させたマウス胎児後根神経節から神経堤幹細胞を単離培養し、内在性のNotch-Deltaシグナルを活性化させない（細胞同士が接触しない）条件で分化誘導を行った。その結果、DICD過剰発現細胞は神経への分化が促進したことからDeltaシグナルはNotchシグナルとは独立したシグナル伝達であることが示唆された。
体節形成：未分節中胚葉においてDICDを過剰発現させると脊椎骨の形成異常を示したことから、体節形成を制御するNotchシグナル活性およびMesp2の発現を調べた。その結果、Notch活性、Mesp2の発現ともにコントロールとの差はなく体節の分節も正常であった。しかしながらDICD過剰発現胚では尾芽が細くなっており、このことが脊椎骨の異常の原因であることが示唆された。
新規Non-cleavable Dll1マウスの作製：これまでの解析で用いたNon-cleavable Dll1ノックインマウスにはイントロンが含まれておらず、コントロール胚においても表現型が観察されている。そこでCRISPRを用いてイントロンを含む新規のNon-cleavable Dll1マウスを作製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度に予定していた神経堤幹細胞の分化誘導実験においてDICDがNotchシグナルとは独立して神経分化を促進することが明らかになった。しかしながら、予定していたDICDと結合するタンパク質をIP-MS/MSによって同定する実験は、現在までに特異的なタンパク質の同定には至っておらず条件検討に時間がかかっている。他方、当初予定にはなかった新規のNon-cleavable Dll1マウス作製は迅速に行われ、DICDによって遺伝子発現が上昇する遺伝子も発見できたことなどから、実験はおおむね順調に進行していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
DICDと結合するタンパク質を同定するためのIP-MS/MS実験を引き続き行う。また、二分子間の相互作用を検出するDuolink In Situ PLA法を用いてDll1シグナルの可視化を検討する。体節形成に関しては、作製したマウスを用いてNotchシグナル活性や、体節時計遺伝子発現を詳細に解析することによりDeltaシグナルの生理作用を詳細に検討する。
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| Causes of Carryover |
IP-MS/MSの条件検討に時間がかかっており、予定していた二分子間の相互作用を検出するDuolink In Situ PLA法を用いてDll1シグナルの可視化を検討することができなかった。次年度はDll1のシグナルの可視化に必要なDuolink In Situ PLA法の試薬代として使用することを計画している。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度はDll1のシグナルの可視化に必要なDuolink In Situ PLA法の試薬代として使用することを計画している。
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| Remarks |
Poster awards: 47th Annual Meeting of the Japanese Society of Developmental Biologist
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