2013 Fiscal Year Research-status Report
根端メリステムの活性制御を行うペプチドホルモンRGF受容体の探索
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25840111
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | National Institute for Basic Biology |
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Principal Investigator |
篠原 秀文 基礎生物学研究所, 細胞間シグナル研究部門, 助教 (40547022)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ペプチドシグナル / 受容体キナーゼ / リガンド受容体ペア / 細胞間情報伝達 / 植物 |
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| Research Abstract |
シロイヌナズナの根端領域で発現しているRGFペプチドは，転写因子PLETHORAタンパク質の発現領域を調節することで根端メリステム活性を制御しているが，どのように情報伝達が行われているかは不明で，受容体の同定は必要不可欠である．申請者はRGFを介した根端メリステム領域の維持機構の解明のためにRGF受容体を同定することを目的とし，研究を進めている．
本年度は，申請者が確立したシロイヌナズナ受容体キナーゼ群の受容体発現ライブラリーと，光反応性RGFペプチドを用いた網羅的結合実験を行い，RGFペプチドを直接結合するふたつの受容体キナーゼを同定した．ふたつの受容体キナーゼは共にRGFの機能する根端で発現していたことから，RGFペプチドの有力な受容体候補と考えられた．そこで受容体キナーゼ遺伝子の二重変異体を観察したところ，野生型と比較して根が短くなる，根端メリステム領域が縮小するという，rgfペプチド遺伝子変異体と同様の形態を示した．さらに受容体キナーゼ二重変異体に対してRGFペプチド投与実験を行ったところ，二重変異体はRGFペプチドに非感受性であることを確認した．以上の結果より，ふたつの受容体キナーゼがRGF受容体として協調的に機能していることを示した．今後RGF受容体変異体中でのPLTタンパク質の発現量や発現領域の確認，根形成に関与する各種マーカー遺伝子の発現の確認などを行い，RGFペプチドを介した細胞間情報伝達の解明に迫っていく．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
受容体発現ライブラリーと光反応性RGF ペプチドを用いた網羅的結合実験により，ふたつのRGF受容体候補遺伝子を見出し，さらに同定した受容体の二重変異体はRGFペプチドに対する感受性を失っていたことを確認し，ふたつの受容体がRGF受容体として機能することを示し，RGF受容体の同定を達成したことから，研究はおおむね順調に進展している．
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| Strategy for Future Research Activity |
RGF受容体変異体中でのPLTタンパク質の挙動を確認する．具体的には，PLT1およびPLT2-GFP融合形質転換体との掛け合わせたシロイヌナズナを作出し，受容体変異体中でのPLTタンパク質の挙動を観察する．さらに作出した株へのRGF投与実験を行い，RGF応答能を失っているかを確認し，RGFペプチド-受容体ペアを介したPLETHORA情報伝達系の制御系の解明に迫る．同時にRGF受容体変異体中での，根形成に関与するDR5やCYCB1など各種マーカー遺伝子の発現を，プロモーターGUS解析によって確認する．
申請時に計画したシロイヌナズナ培養細胞膜画分に存在する130 kDaのRGF結合タンパク質のアフィニティー精製については，先述した網羅的結合実験で同定したふたつの受容体キナーゼのうちのひとつと分子量が一致し，同一の受容体キナーゼである可能性が高まったため，網羅的結合実験で同定したふたつの受容体の機能解析を優先して進める．
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
シロイヌナズナ培養細胞膜画分に存在するRGF結合タンパク質のアフィニティー精製を計画していたが，先述した網羅的結合実験で同定したふたつの受容体キナーゼのうちのひとつと同一の受容体キナーゼである可能性が高まったため，網羅的結合実験で同定したふたつの受容体の機能解析を優先して進めることとした．そのためアフィニティー精製を行うために購入を予定していた実験器具，試薬等の購入を見送ったため．
アフィニティー精製を行うための実験器具，試薬等の購入に充てる．また受容体発現ライブラリーの拡充において必要な培養細胞生育用のチャンバー，RGF受容体変異体の形態観察に必要なシロイヌナズナ生育用チャンバーの購入に充てる．
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