2013 Fiscal Year Research-status Report
エルゴチオネイン代謝酵素群の分子機能、立体構造および生理機能の解析
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25850052
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Kochi University |
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Principal Investigator |
村松 久司 高知大学, 教育研究部総合科学系, 准教授 (90437343)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | エルゴチオネイン / Burkholderia |
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| Research Abstract |
エルゴチオネイン（ERT）は一部の細菌や真菌が生産する抗酸化能を持つアミノ酸類縁体である。ERTは哺乳類や植物にも広く見出され、様々な生物におけるERTの生理機能や代謝様式が注目されている。これまでにERT分解経路の第２段階以降は不明であった。また、ERT生合成に関与する５種類の酵素が報告されているが機能や立体構造の報告はない。
Burkholderia sp. HME13のエルゴチオナーゼ遺伝子の周辺遺伝子を解析したところ、上流にPseudomonas putida由来のウロカナーゼのアミノ酸配列と相同性を示すタンパク質をコードする遺伝子を見出した。この遺伝子をPCRで増幅してpSE420UのNdeI-HindIII部位に連結し、Escherichia coli JM109を形質転換した。100μg/mlアンピシリンを含むLB培地で、形質転換したE. coliを14時間、37℃で振とう培養し、1mM IPTGを加えて、さらに3時間振とうして集菌した。集菌体を20％グリセロールと50mM NaClを含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.2）に懸濁して氷上で超音波破砕し、粗酵素液から目的の酵素を精製した。精製酵素はウロカニン酸には作用せず、チオールウロカニン酸に作用し、ERT分解の第２段階を触媒する酵素であると考えられた。本酵素は55℃、pH7.5で最も高い活性を示し、50℃以下、pH5.0～11.0で安定であった。本酵素のチオールウロカニン酸に対するKm値は30μM、Vmaxは7.1μmol/min/mgであった。本酵素の反応はCu2+とHg2+に阻害された。LC/MSで本酵素の反応生成物を分析した。ERTを単一の窒素源とした培地で培養したBurkholderia sp. HME13の粗酵素液中に本酵素活性を確認したが、LB培地で培養すると活性は検出されなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度の研究でエルゴチオネイン分解の第２段階を触媒すると考えられる新奇酵素を発見し、機能を解析した。Burkholderia sp. HME13のエルゴチオネイン分解経路においてチオールウロカニン酸代謝酵素よりも下流の反応を触媒すると推定される新奇酵素をコードする遺伝子も既に見出しており、次年度中には遺伝子クローニングを完了できると考えている。エルゴチオネイン分解の第１段階の反応を触媒するエルゴチオナーゼ、および第２段階を触媒するチオールウロカニン酸代謝酵素の結晶化条件について検討を始めている。
放線菌を由来とする５種類のエルゴチオネイン生合成酵素遺伝子をPCR法で増幅し、現在、大腸菌を宿主とした遺伝子発現系の構築を試みている。
エルゴチオネイン生合成酵素の研究はわずかに計画より遅れているものの、エルゴチオネイン分解経路の研究は順調に進んでおり、研究全体としてはおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、研究計画通りに推進する予定である。特にBurkholderia sp. HME13を由来とするエルゴチオネイン分解酵素に関する研究が順調に進んでいる。本課題により、これまでわかっていなかったエルゴチオネイン分解経路の全貌を解明できる可能性が高く、より重点的に分解に関わる酵素の研究を進めていく予定である。
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