アミノラクタム代謝酵素群の機能解析と光学活性アミノ酸合成への展開

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25850053
• Research Institution: Toyama Prefectural University
• Principal Investigator: 冨宿 賢一 富山県立大学, 工学部, 研究員 (70392090)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 微生物酵素 / α-アミノラクタム / α-アミノ酸アミド / ラセミ化 / ラセマーゼ

Outline of Annual Research Achievements

前年度までに、α-アミノラクタムを単一の炭素源や窒素源とする培地での土壌サンプルの集積培養により、α-アミノラクタムやα-アミノ酸アミドに作用するラセミ化活性を複数の微生物から見出した。
この前年度までの結果を基に、今年度はまず、単離した微生物を液体培養後集菌し、静止菌体を用いてD-体あるいはL-体のα-アミノラクタムを基質とする菌体反応を行った。一定時間後、残存するα-アミノラクタムの鏡像体過剰率をHPLCにより測定し、そのラセミ化活性を評価した。その結果、α-アミノラクタムに対して再現性良くラセミ化活性を示す8菌株に絞り込んだ。高いラセミ化活性を示したこれら8菌株は、16S rDNA解析と形態観察、生理・生化学的性状試験により同定し、それぞれEnsifer sp.とRhizobium sp.、Shinella sp.の3種類のいずれかに分類された。無細胞抽出液での酵素反応により、α-アミノラクタムに対するラセミ化活性と共に、α-アミノ酸アミドに対するラセミ化活性も評価したところ、低活性ながらも、α-アミノ酸アミドに対しても良好なラセミ化活性を示すことがわかった。最も良好な活性を示したEnsifer sp. 23-3株の酵素について各種クロマトグラフィーによる精製を行い、SDS-PAGE上で単一のバンドを示すまで精製した。精製した酵素を用いその酵素化学的諸性質を明らかにし、遺伝子クローニングを実施するために重要なN-末端アミノ酸配列の情報を得ることができた。