2014 Fiscal Year Research-status Report
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25850067
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
岩井 伯隆 東京工業大学, 生命理工学研究科, 助教 (80376938)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | フッ素化合物 / 芳香族代謝 / ロドコッカス属細菌 / 環境微生物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに研究担当者らは、天然には存在しないフッ素化合物ベンゾトリフルオリド（トリフルオロメチルベンゼン）を分解・脱フッ素化する微生物、ロドコッカス属細菌を発見した。菌体内にベンゾトリフルオリドが取り込まれることで、イソプロピルベンゼン（クメン）代謝に関わる遺伝子産物と相同性が高いタンパク質が複数誘導されることを見出した。ＰＣＲ法によってイソプロピルベンゼン代謝クラスターを構成する遺伝子（４反応に関わる代謝遺伝子７種、検出制御遺伝子２種）ホモログ全ての存在を確認し、タンパク質配列中には幾つかのアミノ酸置換が認められ、この違いがベンゾトリフルオリド認識に関与している可能性が示唆された。つまり、天然に存在しないフッ素化合物に対して、本菌は他の類似構造の化合物代謝系を巧みに変化させて新しい代謝系として機能させている事が明らかとなってきた。
平成２６年度には、これらの遺伝子を大腸菌などの異種発現系を用いて、タンパク質を生産し、酵素反応の解明を試みた。ベンゾトリフルオリドの代謝（４反応）に直接かかわると推測される遺伝子７種類について、全ての遺伝子を大腸菌で発現させることに成功したが、可溶性が低いものが複数存在し、酵素精製には至らなかった。また、初発の反応が４種類のタンパク質の複合発現を必要とし、大腸菌を用いた場合ではこの酵素活性を確認することはできなかった。そこでロドコッカス属細菌と近縁でかつ遺伝子工学的手法が多く構築されているコリネ型細菌を用いて、異種発現系による酵素反応の追跡を試みた。その結果、初発の酵素反応（BtfA1,BtfA2,BtfA3,BtfA4）および、二番目の酵素反応（BtfB）による代謝活性を明らかにできた。これまでに検出できなかったフッ素化合物の存在をNMRにより明らかにした。平成２７年度には、酵素反応による代謝物の同定（確認）を予定している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２６度の当初の目的としていた培養液中のベンゾトリフルオリド代謝産物の解析は、NMRによる解析と、HPLCを用いた生成を駆使し進めているが、分子組成や分子量から推定される構造決定中の化合物と基質に隔たりが大きく、中間代謝物のさらなる解明が必要であると感じられた。そこで並行して、これまでに明らかにした代謝遺伝子群の酵素活性を確認し、個々の反応による反応物の同定を進めた。大腸菌を宿主とした異種発現系だけでは解析できなかったが、コリネ型細菌を宿主と用いる事で、初発の反応と二番目の反応の酵素活性と反応物の存在を明らかにし、ベンゾトリフルオリドが芳香族の酸化経路を経て代謝されていることを明らかにできた。興味深いことに、脱フッ素化は下流の２反応には依存しない可能性がしさされ、新たな分岐経路の存在が示唆された。これまでに予想してきた経路が明らかになりつつあると同時に、新しい展開が示された。
また、これまで本研究で見出したロドコッカス属細菌は遺伝子工学的手法が確立されていなかったが、本年度の研究過程で、遺伝子破壊技術を確立することに成功し、フッ素化合物代謝を明らかにするうえで、盤石な基盤技術を確立することに成功した。この技術の確立によって、今後本菌で必要となる機能相補実験などが可能となり、研究の大きな進捗が期待できる。
以上の進捗状況を総括して、平成２６年度の達成度はおおむね順調であると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
・ベンゾトリフルオリド代謝遺伝子の組換体タンパク質を用いた試験管内反応による反応の再現と実証
平成２６年度にロドコッカス属細菌と近縁でかつ遺伝子工学的手法が多く構築されているコリネ型細菌を発現宿主として用いる事で、２反応の酵素活性を検出することができた。今後の方針として、この反応物の同定による酵素反応の解明と下流酵素についても活性検出と反応物の同定を試みたい。コリネ型細菌、もしくは大腸菌の異種発現系により生産した酵素を精製し、試験管内酵素反応による反応の解析を進めることが目標である。また、これまでの異種発現による解析結果から脱フッ素化経路は途中から分岐している可能性が強く示唆されてきた。そこで、新たな遺伝子の探索手段として、次世代シークエンサーを用いたドラフトゲノムの解明を進める。分岐経路はカテコールやオルトキノン類の代謝能を持つことが推測されるので、これらのアノテーションに注目して、ゲノム中から候補遺伝子を見つけ出す。前年度に遺伝子破壊技術も構築できたので、候補遺伝子の破壊による代謝経路の確認も検討したい。
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| Causes of Carryover |
装置修理などで、想定外の出費があった反面、高速液体クロマトグラフィーによる解析が順調であったことや、カラムの消耗を抑えることで購入を控えることができた。また、遺伝子工学関連の試薬も、大きなトラブルなく進展できたことで消耗品費用を抑えることができた。以上の結果から、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
新たな研究計画として、研究対象微生物のドラフトゲノムシークエンス解析を予定している。これによって、今後の代謝解析に必要な遺伝子情報をあらかじめ用意できるため、研究の飛躍的な進展を期待している。
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