非天然型メロテルペノイド創製を可能とする新規テルペン環化酵素の同定と機能解析

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25850079
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 仲野 千秋 新潟大学, 自然科学系, 助教 (70620376)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: テルペン環化酵素 / メロテルペノイド / 生合成 / 放線菌 / BE-40644

Outline of Annual Research Achievements

BE-40644は放線菌Actinoplanes sp. A40644から単離された抗腫瘍活性、抗HIV活性物質である。本研究はBE-40644の生合成を担うテルペン環化酵素の同定、およびテルペン環化酵素を用いた非天然型メロテルペノイド創製へと展開することを目的とし行った。
本年度はテルペン環化酵素と推定されるORF15の機能を解明するため、in vivo解析を行った。昨年度、BE-40644生合成遺伝子クラスターのORF15の推定活性部位E44をAlaに置換し、pWHM3に連結したプラスミドを作成した。Streptomyces lividansに形質転換し、培養菌体抽出物を解析したところ、特異的な産物が確認できた。しかしながら、生成物は微量であり、構造決定できなかった。このことから本年度は発現系の変更を行った。強力な恒常発現プロモーターrpsJpを有するpKU1021にBE-40644生合成遺伝子クラスターを連結し、Streptomyces avermitilisに形質転換した。菌体抽出物を解析したところ、BE-40644の生産量がpWHM3-BE-40644/S. lividansの系の5倍程度向上した。また、強力な発現プロモーターPtipAを有するpIJ6021に生合成遺伝子クラスターを連結し、S. lividansに形質転換したところ、こちらの系でもBE-40644の生産量の向上が確認できた。続いて、pKU1021-BE40644からorf15またはプレニルトランスフェラーゼホモログorf14を欠損させたプラスミドを構築した。また、orf15の推定活性部位E44またはD185をAlaに置換したプラスミドも構築した。S. avermitilisに形質転換し、菌体抽出物を解析した結果、orf14欠損株およびAla変異株において特異的な生成物が確認できた。これらの産物は十分量生産されていることから、現在単離を進めている。これらのin vivo解析を進めていくことでテルペン環化酵素を同定し、非天然型化合物の創製へと繋げていく。