電子スピン共鳴装置を利用した細菌の抗生物質耐性の解析

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25850096
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 根井 大介 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 食品総合研究所食品安全研究領域, 主任研究員 (70466001)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 抗生物質 / フリーラジカル / ESR / 電子スピン共鳴 / 細菌 / スピントラッピング

Research Abstract

ESR-スピントラッピング法を細菌体内のフリーラジカル解析に適用した例は少なく、分析条件も未確立である。したがって、菌体内のフリーラジカルを捉えるのに最適な条件を明らかにすることを行った。スピントラッピング剤として、5-(2,2-dimethy-1,3-propoxycyclophosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (CYPMPO)、5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide (DMPO)、N-tert-Buthyl-α-phenylnitrone (PBN)を使用し、大腸菌の生存性に及ぼす影響を検討した結果、いずれのスピントラッピング剤も大腸菌に死滅的な影響を与えなかった。ESR分光器にはEMX-plusを使用し、中心磁場3524 G、測定磁場範囲200 G、マイクロ波強度6 mWで測定を行った。大腸菌の懸濁液にスピントラッピング剤の濃度が10 mMとなるように加え、経時的にESRスペクトルを観測した。大腸菌の懸濁液から得られるスペクトル強度は非常に小さいことが判明した。懸濁液の濃度を3 log CFU/mLと8 log CFU/mLの2段階に設定してスペクトルを観測した結果、懸濁液中の菌数はスペクトル強度に影響をほとんど及ぼさなかった。大腸菌数を3 log CFU/mLに調整した懸濁液にアンピシリンおよびカナマイシンを作用させ、その際のESRスペクトルを観測した。時間経過とともに信号強度が増加する傾向が示唆されたが、スペクトル強度が自体は非常に小さく、細菌由来のスペクトルであるかを精査する必要がある。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ESR-スピントラッピング法により細菌体内のフリーラジカル挙動を解析するための分析条件を明らかにすることを目的としてきた。その結果、各種のスピントラッピング剤が大腸菌に死滅的な作用を及ぼさないことを明らかにし、これらのスピントラッピング剤を大腸菌に使用するうえで支障がないことを示した。また、大腸菌の懸濁液をESR分光器で測定するための条件を得られた。一方で、大腸菌の懸濁液から得れらるスペクトル強度は想定よりもかなり小さく、より高精度の解析を行うために、測定条件の更なる適切化を引き続き行う必要が発生した。

Strategy for Future Research Activity

細菌懸濁液から得られるESRスペクトルの強度が想定よりも小さいことを踏まえ、より高精度の解析を行うために、測定条件の一層の適切化を今年度の前半に行う。その後は当初の計画通り、抗生物質を薬剤耐性菌に作用させた際のフリーラジカル挙動を解析する予定であり、抗生物質の感受性とフリーラジカル挙動の関連について明らかにする。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

当初の見込みよりも、効率的に実験を進めることができたため、試薬等の消耗品にかかる支出が計画よりも少なくなり、次年度使用額が発生した。
ESR分光器の測定条件の更なる見直しを行うことを新たに視野に入れており、その目的を達成するために繰り越した研究費で試薬・消耗品を購入する計画である。