2013 Fiscal Year Research-status Report
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25850147
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Fisheries Research Agency |
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Principal Investigator |
馬久地 みゆき 独立行政法人水産総合研究センター, 中央水産研究所, 研究員 (40594007)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | マガキ / グリコーゲン / 2枚貝 / 生理学 |
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| Research Abstract |
マガキは主要な養殖対象種であり、古くから盛んに養殖されてきた。しかしながら、現在でも種苗生産や育成管理において多くの問題が残されている。特に夏場の高水温、性成熟、産卵に伴う生理的活性低下による斃死は大きな問題である。出荷初期は性成熟や産卵の影響で肉質や重量が低下したカキ、放卵・放精により水分の多い水ガキ、未放出の配偶子を大量に保持しグリコーゲンの蓄積が不十分なカキなど低品質な個体が多く出現し、産業上深刻な問題となっている。本課題ではグリコーゲンの蓄積に関与する遺伝子を明らかにするため、次世代シーケンサーを用いて中腸腺および生殖腺を含む周辺組織に発現する遺伝子を網羅的に解析した。
マガキを1年間定期的にサンプリングし、各組織を摘出した。中腸腺よりRNAを抽出し、cDNAライブラリーを作製した。次世代シーケンサーを用いて作製したライブラリーの配列を解読し、得られたリードを全ゲノム配列より予測された遺伝子領域にマッピングし、発現量を算出した。季節変動に伴いmRNAの発現量が変化する遺伝子については遺伝子オントロジー解析を行い、mRNAの発現パターン間での相関関係を分析し、さらに組織別発現解析を行った。
マガキ中腸腺cDNAライブラリーより各1000万リード以上の配列データを得ることができた。遺伝子発現量比較を行った結果、生殖関連遺伝子の多くは季節変化に伴い発現量も変化していた。一方、一部を除き、代謝関連遺伝子の発現量は年間を通して変動が少なかった。また、発現量の変動が大きい遺伝子について組織別発現解析を行ったところ中腸腺や生殖腺の他、閉殻筋においても多く発現していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
グリコーゲン蓄積に関わる遺伝子の網羅的解析を行うため、まずマガキを一年間継続して飼育し、継時的に各組織をサンプリングした。採取した組織よりRNA を抽出し、cDNAライブラリーを作製した。これらのライブラリーを次世代シーケンサーを用いて配列解析した。配列解析も順調に進み、網羅的に発現量の変動する遺伝子を解析することができた。
さらに、次世代シーケンサーの配列解読の結果より発現量が季節により異なる遺伝子を選別し、これらをリアルタイムPCRを用いて詳細な遺伝子の発現動態を調べた。定量PCRの解析によりグリコーゲン蓄積に関わる遺伝子の候補群を絞り込むことができた。しかし、予想以上に発現量の変動する遺伝子が多く、一部は次年度で解析することとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
遺伝子発現の違いを検証するため候補遺伝子の上流解析を行う。
まず、前年度の発現解析より得られた候補遺伝子の転写調節領域を含む上流部の配列解析を行う。グリコーゲン蓄積群と非蓄積群を比較し、配列の違いを見つける。特定遺伝子の上流配列をPCR 法により伸長し、従来法（サンガ―法）により配列を解読する。両群間で配列の異なる場所を特定しようと試みる。配列の異なる部位があれば遺伝子レベルでグリコーゲンの蓄積性の違いを証明することができる。また、上流配列解析の際には近年公開されたマガキのドラフト全ゲノム配列を利用することで研究を有利に進めることができる。
次に、遺伝子発現を調節するDNA 結合タンパク質、すなわち、転写調節因子の解析を行う。遺伝子発現を制御する一因はタンパク質とDNA の相互作用である。DNA 上の転写開始点に特定のタンパク質が結合することにより転写が開始される。グリコーゲン蓄積群と非蓄積群において転写因子の結合部位や結合状況を比較する。まず、DNA と相互作用するタンパク質を架橋結合させた後に断片化し、次にタンパク質抗体を用いて免疫沈降を行い、DNA・タンパク質複合体を回収する。さらにDNA を精製し、シーケンスライブラリーを作製し、シーケンサーで配列を解読する。２群の解析結果を比較し、タンパク質結合部位や結合状況に違いを見つける。
さらに遺伝子のコピー数多形を調べ、遺伝子発現の違いを検証する。目的遺伝子のゲノム中のコピー数が遺伝子の発現量を調節することが考えられるので、ゲノム中の遺伝子数を測定するため、リアルタイムPCR 法を用いてグリコーゲン蓄積群と非蓄積群のゲノム中の候補遺伝子の数を比較し、コピー数多形が存在するか確かめる。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
遺伝子発現変動を解析するための研究計画に軽微な変更が生じたため、遺伝子解析用物品を一部、次年度に購入することとなった。
H26年8月までにグリコーゲン蓄積に関連する遺伝子の詳細な発現変動を解析する。
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