マレック病ウイルス新規ワクチンの開発：宿主免疫抑制機構の緩和による効果増強

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25850194
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 村田 史郎 北海道大学, (連合)獣医学研究科, 助教 (10579163)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: マレック病 / マレック病ウイルス / 感染性クローン / 組換えウイルス / 免疫抑制因子 / PD-1 / PD-L1 / 組換えワクチン

Research Abstract

本研究ではニワトリに悪性リンパ腫をひき起こすマレック病（MD）に対する新規ワクチンの開発を行う。現在、MDは弱毒生ワクチンによってほぼ制圧されているが、野外においてマレック病ウイルス（MDV）は病原性が増強する傾向にある。そのため、より効果の高い抗MDワクチンの開発をするため、既存のワクチンに比べ生体内での高い増殖率を持ち、さらに免疫抑制及び免疫応答の終結に機能するProgrammed death-1 (PD-1) とProgrammed death-ligand 1 (PD-L1) の結合を阻害させることにより、既存のワクチンより高い免疫誘導能を有するワクチン作製を目指す。
今年度は、まず新規抗MDワクチン（組換えMDV）の作製を行った。組換えMDVの作製には、生体内での増殖を改善するため、MDV強毒株（RB1B株）に由来する感染性クローンを用いた。PD-1遺伝子細胞外領域をクローニングし、ウサギ免疫グロブリンの定常部と連結させ (PD-1-Ig)、En Passant Mutagenesis法によりRB1B株のmeq遺伝子と置換させた。meq遺伝子はMDVによる病態形成に必須であるため、meq遺伝子をノックアウトすることでMDVの病原性は損なわれる。得られたクローンのうち、PD-1-Ig遺伝子を持ち、meq遺伝子を持たないクローンをRFLP、PCR及び遺伝子解析により確認し、meq遺伝子とPD-1-Ig遺伝子を置換させた感染性クローン (RB1B/PD-1/ΔMeq)を複数得た。また、作製したRB1B/PD-1/ΔMeqを培養細胞に導入し、組換えウイルスとして再生させた。
次いで、ワクチン効果検討に用いる強毒MDVの作製を行った。MDVの病原性はmeq遺伝子の多型と関連することが知られている。そこで、RB1B株感染性クローンのmeq遺伝子と既知の強毒MDV株のmeq遺伝子をEn Passant Mutagenesis法により置換させた感染性クローンを作製した。また、強毒組換えMDVクローンを培養細胞に導入し、Cre-lox/Pシステムによりベクター配列（pBeloBAC-11）を除いた組換えウイルスを再生させた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究計画では、平成25年度に抗MD組換えワクチンの作製及びワクチン効果判定に用いる強毒MDVの作製を行い、平成25～26年度に組換えワクチンの性状解析、平成26年のワクチンの効果判定を実施する予定である。現在の進捗状況として、組換えワクチンの作製及強毒MDVの作製は、組換えウイルスの再生を含めてすでに終了しており、in vitroにおける組換えワクチンの性状解析について現在進めている。以上のように、当初計画と比べて概ね順調に進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

今年度に作製した抗MD組換えワクチンのin vitroにおける性状を解析し、そのワクチン効果をin vivoにて検討を行う。まず、RB1B/PD-1/ΔMeqのin vitroにおける増殖能についてプラークアッセイにより検討し、in vivoについてはRB1B/PD-1/ΔMeq接種鶏から経時的に末梢血を採材し、既存のワクチンを接種した鶏群とreal-time PCR法によるウイルスゲノムの定量を行い比較する。次いで、RB1B/PD-1/ΔMeqの生体への安全性（臨床症状の観察）の確認を行い、さらに細胞性免疫誘導能についてサイトカインの発現をreal-time PCR法またはELISA法により定量し検討する。最後にワクチンの効果判定試験を、MD感受性鶏を用いた感染実験により、生存率および腫瘍形成率を既存のワクチン接種鶏群と比較することで検討する。通常ワクチン接種は1,000Uで行われるが、本研究では、より明確に効果判定を行うため、通常より少ないドーズで接種を行い、ワクチン効果を比較する。初生ヒナにRB1B/PD-1/ΔMeqまたは既存のワクチン株を接種し、３日後に強毒MDV感染性クローンを接種し、約２ヶ月間経過を観察し生存率を比較する。また、観察期間中に発症しなかったヒナについては、腹腔内に腫瘍の形成が認められるか観察する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

今年度は新規抗MD組換えワクチン（RB1B/PD-1/ΔMeq）の作製を行った。作製した組換えワクチンの性状解析を行うために必要な試薬（抗体）をすでに発注済みである。しかし、受注生産品であるため納期が次年度となり、その試薬代（約48万円）を次年度の使用とした。また、研究遂行のために必要で、3月に発注を行った試薬・消耗品類（約26万円）と合わせて、その総額を次年度の使用とした。
次年度使用額のうち、約48万円については、研究遂行上必要な試薬（抗体3点）をすでに発注しているが、受注生産品で納期に時間がかかり次年度納品となることから、その支払いに使用する。残りについては研究遂行のため必要であり、3月に発注を行った試薬・消耗品類（約26万円）の支払いに使用する。

Research Products

• [Journal Article] Identification and sequence characterization of novel Theileria genotypes from the waterbuck (Kobus defassa) in a Theileria parva-endemic area in Kenya. (2014)
  • Author(s): Githaka N, Konnai S, Bishop R, Odongo D, Lekolool I, Kariuki E, Gakuya F, Kamau L, Isezaki M, Murata S, Ohashi K.
  • Journal Title: Vet Parasitol. Volume: 28 Pages: 180-193
  • DOI: 10.1016/j.vetpar.2014.02.056.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Expression analysis of programmed death ligand 2 in tumors caused by the avian oncovirus Marek’s disease virus. (2014)
  • Author(s): Matsuyama-Kato, A., Murata, S., Isezaki, M., Takasaki, S., Kano, R., Konnai, S. and Ohashi, K.
  • Journal Title: Arch. Virol. Volume: In press Pages: In press
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Influence of PD-L1 cross-linking on cell death in PD-L1-expressing cell lines and bovine lymphocytes. (2014)
  • Author(s): Ikebuchi, R., Konnai, S., Okagawa, T., Yokoyama, K., Nakajima, C., Suzuki, Y., Murata, S. and Ohashi, K.
  • Journal Title: Immunology Volume: In press Pages: In press
  • DOI: doi: 10.1111/imm.12243.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Suppressive effects of neutrophil by Salp16-like salivary gland proteins from Ixodes persulcatus Schulze tick. (2014)
  • Author(s): Hidano A, Konnai S, Yamada S, Githaka N, Isezaki M, Higuchi H, Nagahata H, Ito T, Takano A, Ando S, Kawabata H, Murata S, Ohahsi K.
  • Journal Title: Insect Mol. Biol. Volume: In press Pages: In press
  • DOI: doi: 10.1111/imb.12101.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Characterization of Meq proteins from field isolates of Marek’s disease virus in Japan. (2013)
  • Author(s): Murata, S., Hashiguchi, T., Hayashi, Y., Yamamoto, Y., Matsuyama-Kato, A., Takasaki, S., Isezaki, M., Onuma, M., Konnai, S. and Ohashi, K.
  • Journal Title: Infect. Genet. Evol. Volume: 16 Pages: 137-143
  • DOI: doi: 10.1016/j.meegid.2012.12.032.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Horizontal transmission of bovine leukemia virus from lymphocytotic cattle, and beneficial effects of insect vector control. (2013)
  • Author(s): Ooshiro, M., Konnai, S., Katagiri, Y., Afuso, M., Arakaki, N., Tsuha, O., Murata, S. and Ohashi K.
  • Journal Title: Vet. Rec. Volume: 173 Pages: 527
  • DOI: doi: 10.1136/vr.101833.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Expression analysis of Foxp3 in T cells from bovine leukemia virus infected cattle. (2013)
  • Author(s): Suzuki, S., Konnai, S., Okagawa, T., Ikebuchi, R., Shirai, T., Sunden, Y., Mingala, C.N., Murata, S. and Ohashi, K.
  • Journal Title: Microbiol. Immunol. Volume: 57 Pages: 600-604
  • DOI: doi: 10.1111/1348-0421.12073.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Blockade of bovine PD-1 increases T cell function and inhibits bovine leukemia virus expression in B cells in vitro. (2013)
  • Author(s): Ikebuchi, R., Konnai, S., Okagawa, T., Yokoyama, K., Nakajima, C., Suzuki, Y., Murata, S. and Ohashi, K.
  • Journal Title: Vet. Res. Volume: 44 Pages: 59
  • DOI: doi: 10.1186/1297-9716-44-59.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Genotypic variations in field isolates of Theileria species infecting giraffes (Giraffa camelopardalis tippelskirchi and Giraffa camelopardalis reticulata) in Kenya. (2013)
  • Author(s): Githaka, N., Konnai, S., Skilton, R., Kariuki, E., Kanduma, E., Murata, S. and Ohashi, K.
  • Journal Title: Parasitol. Int. Volume: 62 Pages: 448-453
  • DOI: doi: 10.1016/j.parint.2013.06.002.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Bovine whole-blood culture as a tool for the measurement of endotoxin activities in Gram-negative bacterial vaccines. (2013)
  • Author(s): Imamura, S., Nakamizo, M., Kawanishi, M., Nakajima, N., Yamamoto, K., Uchiyama, M., Hirano, F., Nagai, H., Kijima, M., Ikebuchi, R., Mekata, H., Murata, S., Konnai, S. and Ohashi, K.
  • Journal Title: Vet. Immunol. Immunopathol. Volume: 153 Pages: 1513-1521
  • DOI: doi: 10.1016/j.vetimm.2013.02.002.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Enhanced expression of LAG-3 on lymphocyte subpopulations from persistently lymphocytotic cattle infected with bovine leukemia virus. (2013)
  • Author(s): Konnai, S., Suzuki, S., Shirai, T., Ikebuchi, R., Okagawa, T., Sunden, Y., Mingala, C.N., Onuma, M., Murata, S. and Ohashi, K.
  • Journal Title: Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. Volume: 36 Pages: 63-69
  • DOI: doi: 10.1016/j.cimid.2012.09.005.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Identification and partial characterization of a gut Rhipicephalus appendiculatus cystatin. (2013)
  • Author(s): Imamura, S., Konnai, S., Yamada, S., Parizi, L.F., Githaka, N., Vaz, I. da S. Jr., Murata, S. and Ohashi, K.
  • Journal Title: Ticks Tick Borne Dis. Volume: 4 Pages: 138-144
  • DOI: doi: 10.1016/j.ttbdis.2012.11.001.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Prevalence of Lyme Borrelia in Ixodes persulcatus Ticks from an Area with a Confirmed Case of Lyme Disease. (2013)
  • Author(s): MuraseY., Konnai, S., Githaka, N., Hidano, A., Taylor, K., Ito, T., Takano, A., Ando, S., Kawabata, H., Tsubota, T., Murata, S. and Ohashi, K.
  • Journal Title: J. Vet. Med Sci. Volume: 75 Pages: 538-540
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 免疫抑制受容体PD-1のリガンドPD-L2の機能的特徴と臨床応用研究 (2013)
  • Author(s): 西森朝美, 今内覚, 池渕良洋, 岡川朋弘, 村田史郎, 大橋和彦
  • Journal Title: 動物用ワクチンーバイオ医薬品研究会ニュースレター Volume: 7 Pages: 19-20
• [Journal Article] 牛白血病ウイルスの感染予防対策 (2013)
  • Author(s): 今内覚, 村田史郎, 大橋和彦
  • Journal Title: DAIRYMAN Volume: 30 Pages: 60-62
• [Journal Article] Isolation, cloning, and pathologic analysis of Trypanosoma evansi field isolates. (2013)
  • Author(s): Mekata H, Konnai S, Mingala CN, Abes NS, Gutierrez CA, Dargantes AP, Witola WH, Inoue N, Onuma M, Murata S, Ohashi K.
  • Journal Title: Parasitol. Res. Volume: 112 Pages: 1513-1521
  • DOI: doi: 10.1007/s00436-013-3297-3.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Epidemiological research of Borrelia miyamotoi in Hokkaido. (2013)
  • Author(s): Yoshimura, H., Konnai, S., Toyomane, K., Takano, A., Kawabata, H., Murata, S. and Ohashi, K.
  • Organizer: The 1st Sapporo Summer Seminar for One Health
  • Place of Presentation: Hokkaido University, Sapporo
  • Year and Date: 20130925-20130926
• [Presentation] Upregulation of immunoinhibitory receptor Tim-3 leads to T-cell dysfunction in cattle infected with bovine leukemia virus. (2013)
  • Author(s): Okagawa, T., Konnai, S., Ikebuchi, R., Murata, S. and Ohahsi, K.
  • Organizer: The 1st Sapporo Summer Seminar for One Health
  • Place of Presentation: Hokkaido University, Sapporo
  • Year and Date: 20130925-20130926
• [Presentation] IgMhigh B cells are increase in number and prone to express viral antigen in bovine leukemia virus-infected cattle. (2013)
  • Author(s): Ikebuchi, R., Konnai, S., Okagawa, T., Nishimori, A., Nakahara, A., Murata, S. and Ohashi, K.
  • Organizer: The 1st Sapporo Summer Seminar for One Health
  • Place of Presentation: Hokkaido University, Sapporo
  • Year and Date: 20130925-20130926
• [Presentation] 牛白血病発生農場におけるサシバエ種の同定とウイルスの検出 (2013)
  • Author(s): 今内覚, 豊間根耕地, 小池菜々子, 伊東拓也, 村田史郎, 大橋和彦
  • Organizer: 第156回日本獣医学会学術集会
  • Place of Presentation: 岐阜大学、岐阜
  • Year and Date: 20130920-20130922
• [Presentation] シュルツェマダニ由来免疫抑制因子の機能解析 (2013)
  • Author(s): 豊間根耕地, 今内覚, 伊東拓也, 川端寛樹, 高野愛, 安藤秀二, 村田史郎, 大橋和彦
  • Organizer: 第156回日本獣医学会学術集会
  • Place of Presentation: 岐阜大学、岐阜
  • Year and Date: 20130920-20130922
• [Presentation] イヌ免疫抑制因子PD-1およびPD-L1の同定と新規免疫療法樹立への基礎研究 (2013)
  • Author(s): 前川直也, 今内覚, 池渕良洋, 岡川朋弘, 高木哲, 村田史郎, 大橋和彦
  • Organizer: 第156回日本獣医学会学術集会
  • Place of Presentation: 岐阜大学、岐阜
  • Year and Date: 20130920-20130922
• [Presentation] ウシ免疫抑制因子PD-L1およびPD-L2の組換えタンパク質作製と免疫機能解析 (2013)
  • Author(s): 西森朝美, 今内覚, 池渕良洋, 岡川朋弘, 村田史郎, 大橋和彦
  • Organizer: 第156回日本獣医学会学術集会
  • Place of Presentation: 岐阜大学、岐阜
  • Year and Date: 20130920-20130922
• [Presentation] マレック病腫瘍病変形成における免疫抑制因子発現機構の検討 (2013)
  • Author(s): 松山あゆ美, 村田史郎, 伊勢崎政美, 今内覚, 大橋和彦
  • Organizer: 第156回日本獣医学会学術集会
  • Place of Presentation: 岐阜大学、岐阜
  • Year and Date: 20130920-20130922
• [Presentation] 全血培養法によるエンドトキシン活性測定の有用性の検討 (2013)
  • Author(s): 今村採貴, 中溝万里, 川西路子, 池渕良洋, 目堅博久, 村田史郎, 今内覚, 大橋和彦, 中島奈緒, 山本欣也, 内山万利小, 平野文哉, 永井英貴, 木島まゆみ
  • Organizer: 第156回日本獣医学会学術集会
  • Place of Presentation: 岐阜大学、岐阜
  • Year and Date: 20130920-20130922
• [Presentation] 牛白血病ウイルス感染牛由来IgMhighB細胞のウイルス抗原発現解析及び性状解析 (2013)
  • Author(s): 池渕良洋, 今内覚, 岡川朋弘, 西森朝美, 中原綾子, 村田史郎, 大橋和彦
  • Organizer: 第156回日本獣医学会学術集会
  • Place of Presentation: 岐阜大学、岐阜
  • Year and Date: 20130920-20130922
• [Presentation] 国内に潜在すると考えられる新興回帰熱に関する疫学調査研究 (2013)
  • Author(s): 高野愛, 川端寛樹, 大久保（佐藤）梢, 中尾稔, 伊東拓也, Kyle Taylor, 李景利, 坪田敏男, 今内覚, 吉村英紘, 豊間根耕地, 村田史郎, 大橋和彦
  • Organizer: 第156回日本獣医学会学術集会
  • Place of Presentation: 岐阜大学、岐阜
  • Year and Date: 20130920-20130922
• [Presentation] Establishment of anti-bovine PD-1 monoclonal antibody and increase of anti-viral response by PD-1 blockade in bovine leukemia virus-infected cattle. (2013)
  • Author(s): Ikebuchi, R., Konnai, S., Okagawa, T., Yokoyama, K., Nakajima, C., Suzuki, Y., Murata, S. and Ohashi K.
  • Organizer: 10th International Veterinary Immunology Symposium
  • Place of Presentation: University of Milan, Italy
  • Year and Date: 20130828-20130901
• [Presentation] Regulation of T cell exhaustion by blockade of PD-L1 and LAG-3 in persistently lymphocytotic cattle infected with bovine leukemia virus. (2013)
  • Author(s): Konnai, S., Ikebuchi, R., Okagawa, T., Murata, S. and Ohashi, K.
  • Organizer: 10th International Veterinary Immunology Symposium
  • Place of Presentation: University of Milan, Italy
  • Year and Date: 20130828-20130901
• [Presentation] Regulatory dendritic cells play an important role in the control of trypanosoma evansi-induced massive inflammation. (2013)
  • Author(s): Mekata, H., Konnai, S., Mingala, C., Inoue, N., Murata, S. and Ohashi, K.
  • Organizer: 10th International Veterinary Immunology Symposium
  • Place of Presentation: University of Milan, Italy
  • Year and Date: 20130828-20130901
• [Presentation] Increased expressions of immunoinhibitory receptor TIM-3 and its ligand during bovine leukemia virus infection. (2013)
  • Author(s): Okagawa, T., Konnai, S., Ikebuchi, R., Murata, S. and Ohashi, K.
  • Organizer: 10th International Veterinary Immunology Symposium
  • Place of Presentation: University of Milan, Italy
  • Year and Date: 20130828-20130901
• [Book] Recent viral disease of Japanese Anatid with a fatal case of Marek’s disease in an endangered species, white-fronted goose (Anser albifrons), In Ducks: Habitat, Behavior and Diseases (2013)
  • Author(s): Asakawa, M., Nakade, T., Murata, S., Ohashi, K., Osa, Y. and Taniyama, H.
  • Total Pages: 70 (37-47)
  • Publisher: Nova Science Publishers