2013 Fiscal Year Research-status Report
イヌiPS細胞や体性幹細胞由来肝組織による薬物代謝評価系の確立
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25850214
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Azabu University |
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Principal Investigator |
根尾 櫻子 麻布大学, 獣医学部, 助教 (50532107)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 骨髄 / 肝細胞 / 分化誘導 / 長期培養 |
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| Research Abstract |
本研究の目的は、イヌiPS細胞や体性幹細胞を用いて、生体外で三次元肝組織を作製し、新規薬物代謝及び毒性試験の可能なスクリーニングチップとして確立することである。iPSや体性幹細胞をソースとすることで、生体外では長期生存が不可能である肝細胞培養系の問題点を克服し、培養肝細胞・組織の安定供給を図ること、また、個人差のある肝代謝を生体外で再現することで、重篤な薬物毒性の危険性を排除することを目指している。さらに、このような薬物スクリーニングチップによって、創薬研究での動物実験代替法となることを期待している。
平成25年は、イヌiPS細胞や体性幹細胞から二次元下で肝細胞への分化誘導を実施し、次に行う三次元人工肝組織作製に最適な細胞ソースを決定し、その後、最適な培養条件設定を行うという計画を立てた。この計画に従って、まず、体性幹細胞を含む骨髄細胞をソースとして、培養基材に本邦で開発された最先端技術である、「温度応答性培養皿」を用いて、骨髄細胞から二次元的に誘導した肝細胞のシートを三次元的に組織化することから着手した。二次元的に得られた細胞シートに関しては、形態観察および定性的、定量的PCRと免疫染色にて、最も肝特異的で普遍的マーカーであるアルブミンの産生などを比較検討した。骨髄由来肝様細胞は、定性的PCRで成熟肝細胞マーカー（Albumin、HGF、CK18）、薬物代謝酵素（CYP1A1）、糖新生マーカー（PEPCK）および肝前駆細胞マーカー（CD90、CD44）のmRNAを発現し、Albuminの定量的PCRでは、骨髄細胞と比較して発現量が高くなることを確認した。さらに、2か月を超える長期培養においても発現が維持された。これらのことから、骨髄由来肝様細胞は、長期間培養した状態でも肝前駆および成熟細胞の性質を持つことが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
25年には、①最適なソースと培養基材の決定と②三次元人工肝を構築する上で適切なプロトコールの決定を行う予定であった。しかし、まず体性幹細胞を含んだ骨髄細胞を温度応答性培養皿で培養し、三次元化するところでシートの三次元化がうまくいかず、この検討に時間を費やしてしまった。おそらくこの原因はマウスや人との肝細胞の性質の違いが関連していると考えられる。犬の肝細胞の場合は細胞を支える構造（血管構造など）と同時に培養しない限りはうまくいかないのかもしれない。しかし、培養条件を検討する中で、分化培養した肝様細胞が長期間肝細胞の性質を持つことを発見したことは有効であると考えられた。通常フィーダー細胞なしで初代肝細胞培養を行うと、肝細胞は採取後約1週間しか生存を維持できず、特に薬物代謝試験には支障をきたす。このため、長期間培養可能な肝様細胞は今後、生体外で薬物代謝評価を行う肝細胞に代わるソースとして有効と考えられる。①の詳細としては、細胞認識性マトリックス（E-カドヘリン基材）での培養も検討する計画であったがまだ検討できていないため、これは温度応答性培養皿の検討を進めたうえで必要か否かを検討したい。②に関する詳細として、長期間培養が可能な最適条件に有効な添加する増殖因子及びサイトカインを引き続き現在も検討している。その他、酸素濃度に関する検討として幹細胞維持に最適とされる低酸素5%O2下での培養効率を検討する予定であったが、定性的PCRによって長期培養した肝様細胞内に肝前駆細胞の存在が明らかになったため、これらを集積して今後低酸素5%O2下でも培養効率を検討する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究方針は、①25年にうまくいかなかった「骨髄細胞の温度応答性培養皿で培養」に対する問題解決を行い、最適なソースと培養基材の決定すること、また、引き続き②三次元人工肝を構築する上で適切なプロトコールの決定を行い、イヌ初代肝細胞培養系で得られる結果と比較検討し、生体肝に最も類似する条件を確定し、さらに③25年に明らかとなった分化培養した肝様細胞の長期間性質維持に関する検討を行う計画である。①に関しては、温度応答性培養皿以外のEカドヘリン接着培養基材を培養基材として、三次元培養を試み、もし、計画通りにいかなかった場合はそのほかのスフェロイド培養基材であるCell-ableTM96well plate (トランスパレント) や、Micro Sphere Array (STEMバイオメソッド) に基材を変更して三次元人工肝作製を試みる。②と③に関しては、骨髄由来肝様細胞を長期間培養する最適条件を決定するために、増殖因子及びサイトカイン（HGF、EGF、OSM、IL1、IL6、ヒト胎盤抽出液）の検討を行う計画である。さらに長期培養した際にも効率よく肝細胞に類似した機能を持つかどうかの評価を行うために、肝特異的分子RNAとタンパク質の発現、および肝機能の発現に加えて、CYP450、尿素、糖質、脂質代謝能に関して多角的に解析する。また、定性的PCRで明らかとなった肝前駆細胞に関して、長期培養可能なソースとして、ソーティング技術により分離検討することを試みる予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
25年は、温度応答培養皿のみで培養条件検討に時間を費やしたが、未だ三次元人工肝作成に最適な基材を決定するに至っていないため、26年に新たな培養機材を検討する予定である。また、培養した細胞の評価を詳細に行っておらず、遺伝子実験や細胞の機能検査に必要な予算を25年に使用しなかったため、26年に繰り越した。さらに、25年は骨髄から体性幹細胞を分離するに至っておらず、それらを分離するために必要な試薬は26年に使用したい。
培養機材に関しては、Eカドヘリン接着培養基材、スフェロイド培養基材や、Micro Sphere Arrayに基材を変更して三次元人工肝作製を試み、骨髄から誘導培養した肝様細胞の検討のためには、免疫染色用抗体に加えて、遺伝子関連試薬と細胞機能検査の試薬を購入する計画である。さらに、体性幹細胞のソーターでの分離培養をするための抗体や試薬、また得られた細胞の評価するための遺伝子関連および免疫染色用抗体に使用する計画である。
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Research Products
(1 results)
