イヌiPS細胞や体性幹細胞由来肝組織による薬物代謝評価系の確立

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25850214
• Research Institution: Azabu University
• Principal Investigator: 根尾 櫻子 麻布大学, 獣医学部, 助教 (50532107)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 骨髄 / 肝細胞 / 分化誘導 / 長期培養

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、犬iPSや体性幹細胞を用いて、生体外で三次元間組織を作成し、新規薬物代謝および機能試験の可能なスクリーニングチップとして確立することである。iPSや体性幹細胞をソースとすることで、生体外では長期生存不可能である肝細胞培養系の問題点を克服し、培養肝細胞・組織の安定供給を図ること、また、個人差のある艦隊者を生体外で再現することで、貴重な薬物毒性の奇形誠意を排除することを目的としている。さらにこのような薬物スクリーニングチップによって、創薬研究での動物実験代替法となることを期待している。
平成25年度は、イヌ体性幹細胞を含む骨髄細胞をソースとして、培養基材には、新たな試みとして、本邦で開発された最先端技術である、「温度応答性培養皿」を用い、骨髄細胞から二次元的に誘導した肝細胞のシートを三次元的に組織化することに着手した。これらの細胞に関しては形態観察および定性的、定量的PCRと免疫染色を行い、成熟肝細胞マーカー(Albumin, HGF, CK18)、薬物代謝（CYP1A1）糖新生マーカー(PEPCK)および肝前駆細胞マーカー（CD90, CD40）のmRNA発現を検討した。また、定量的PCRにて、最も肝特異的である普遍的マーカーであるアルブミンの産生などを比較検討した。平成26年度は、「肝特異的分子RNAとタンパク質の発現、および肝機能の発現をCYP450、尿素、糖質、脂質代謝能に関して多角的に解析する」という目標を立て、計画に着手した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

26年は産休のために研究期間を延長する届出をした。このため、当初の計画よりもやや遅れている。また、当初の予定では、26年は、肝特異的分子RNAとタンパク質の発現、および肝機能の発現をCYP450、尿素、糖質、脂質代謝能に関して多角的に解析し、これらを、イヌ初代肝細胞培養系で得られる結果と比較検討し、生体肝に最も類似する条件を確定する計画であった。具体的にはiPS細胞および体性幹細胞由来の人工肝組織の性状を知るために、肝細胞特異的マーカー（AFP、アルブミン、HNF4、AGP、α2-microglobulin, ヘプシジンなど）と細胞間相互作用に関わる分子（インテグリンα4, デコリンなど）の発現を、定量的PCRおよび免疫染色にて確認し、また、細胞の機能発現は、糖代謝をPAS染色で、脂質代謝をLDL取り込み能で、また、薬物代謝能をCYP450測定で、さらに解毒作用を尿素産生能で検討する予定であった。また、本研究の主目的である、正確な薬物代謝評価が可能な人工肝開発には、CYP発現の確証が必須である。イヌでは現在までに9つのCYP450の発現を遺伝子およびタンパクレベルで詳細に解析する計画であった。しかし、26年度は平成25年度に達成できなかった細胞シートの三次元化の検討を継続して行ったため、全体的に遅めのスタートであった。長期間培養が可能であると明らかになった体性幹細胞由来の人工肝組織の性状の変化を知るために継時的に肝細胞特異的マーカー（アルブミン）の発現を検討できたことは今後の研究につながると考えられる。細胞の機能発現に関しては、糖代謝、脂質代謝、薬物代謝能をCYP450測定する方法を検討中である。

Strategy for Future Research Activity

平成25年度に達成ができず、また26年度も完成に至っていない「骨髄細胞の温度応答性培養皿での培養」の解決を行い、生体肝細胞に、より類似した肝様細胞へ分化させるための最適ソースと培養機材の決定を確実なものとする。平成26年度に手がけた長期培養を行った体性幹細胞由来の人工肝組織の性状の検討はひき続き行う。具体的にはまず二次元培養した肝細胞のシートを酸素供給が望めると考えられている血管内皮細胞との共培養を試み、さらにこれらを積層することで三次元構造の作製を試みる。さらに、産休で27年度に持ち越した、当初の26年度の計画にのっとり、肝細胞への分化度の検討は、肝細胞特異的マーカー（AFP、アルブミン、HNF4、AGP、α2-microglobulin, ヘプシジンなど）と細胞間相互作用に関わる分子（インテグリンα4, デコリンなど）の発現を、定量的PCRおよび免疫染色にて確認し、また、細胞の機能発現は、糖代謝をPAS染色で、脂質代謝をLDL取り込み能で、また、薬物代謝能をCYP450測定で、さらに解毒作用を尿素産生能で検討する。
また、長期培養をする中で、小型肝細胞様の増殖活性の高い細胞が観察されたことから、今後はまず小型肝細胞のマーカーであるCD44を用いて免疫染色を行い、肝増殖に関わる細胞を特定するなど、小型肝細胞に関する検討も含めて行いたい。小型肝細胞は増殖力が高く、本研究目的である、生体外で三次元間組織を作成して新規薬物代謝および機能試験の可能なスクリーニングチップとして確立するための培養ソースとして有効であると考えられる。このため、ソーティング技術により分離することも視野に入れて研究を行いたい。

Causes of Carryover

26年度は産休のために研究期間を延長する届出をした。これが、繰越金額が多い大きな理由である。27年度は当初26年度に予定していた肝細胞の機能的発現に関する検討（糖代謝、脂質代謝、薬物代謝、尿素産生能）を行う条件を検討する必要があり、これに充てる費用が必要である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

骨髄から誘導培養した肝様細胞の検討には、免疫染色用抗体に加えて、遺伝子関連試薬と細胞機能検討試薬を購入する計画である。さらににソーティングを視野に入れて小型肝細胞に関して検討する際に必要な抗体や試薬、また得られた細胞の評価をするための遺伝子、免疫染色用抗体に使用する計画である。