2014 Fiscal Year Annual Research Report
カイコ小球細胞欠如突然変異体の原因遺伝子の同定～存在意義が不明な血球の謎に迫る～
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25850228
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
木内 隆史 東京大学, 農学生命科学研究科, 助教 (60622892)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | カイコ突然変異体 / 血球 / 小球細胞 / 分化系譜 / ゲノム編集 / 遺伝学 / 分子生物学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昆虫の血球は生体防御や傷の治癒に関与している。血球の種類は大きく分けて5つ存在し、それぞれの血球種の機能や分化系譜が調べられているが、そのうち小球細胞に関してはその機能および分化系譜がほとんど未知である。私たちは昆虫種で唯一小球細胞を欠く突然変異体（sprとSph）が維持されているカイコを用いて、その原因遺伝子を単離することにより、小球細胞の機能と分化系譜に迫ろうと考えている。
平成26年度はポジショナルクローニングによるsprの絞り込みを進め、2個の遺伝子まで絞り込んだ。そのうちの１つは機能既知の遺伝子で候補から除外できたため、もう１つの遺伝子が原因遺伝子であると予想し配列解析を行った。その結果、突然変異体では遺伝子配列内に欠失が存在することが判明した。
欠失が確認された遺伝子の機能を証明するために、in vivo transfection法により原因遺伝子を変異系統に一過的に導入し、機能復帰を試みた。結果として小球細胞様の血球を確認することができた。また、予定通りCRISPR/Cas9による原因遺伝子のノックアウト（KO）を行おうと考えたが、通常KOカイコの樹立に用いる非休眠系統は小球細胞が存在せず使用することができなかった。一方、調べた限りでは小球細胞をもつ系統は基本的に休眠卵を産下するため、KOカイコの作製に必須な卵への核酸注入に適さなかった。この問題を解決するために、休眠に関与する遺伝子をsiRNAでノックダウンすることで休眠を打破しつつKOを行う方法を考案した。今後は、考案した方法でKOカイコを樹立し原因遺伝子の機能を証明することと、樹立したKOカイコを用いて小球細胞の機能と分化系譜を明らかにしたいと考えている。
また、Sphのポジショナルクローニングも平行して行い、原因遺伝子が存在するScaffoldまで特定することができた。しかし、その後予想に反しPCR多型マーカーを構築することに困難を要したため、それ以上の絞り込みはできなかった。
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