微小ハイドロゲルファイバー内充填培養によるヒト肝複合組織体の薬物代謝研究への応用

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25860124
• Research Institution: Teikyo Heisei University
• Principal Investigator: 大野 まき 帝京平成大学, 薬学部, 講師 (80366765)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 肝細胞 / 薬物代謝

Outline of Annual Research Achievements

ヒトにおける薬物のin vivo代謝を予測するためには、薬物代謝酵素やトランスポーターの活性を長期間保持したヒト肝組織を用いる必要があるが、生体外から分離された肝細胞の薬物代謝酵素活性は分離数日後にほぼ消失する。このため、肝細胞機能を長期間保持したヒト肝細胞培養系の構築が必要である。本研究では、凍結ヒト肝細胞から増殖能を有するヒト肝前駆細胞を分離し、血管内皮細胞との共培養などにより薬物代謝評価に有用な培養系を作成することを目的とした。
凍結ヒト肝細胞を低速で遠心分離し、ヒアルロン酸をコートした培養皿に播種し、ヒトとマウスの血清やEGFＦ、ニコチンアミド、マウス繊維芽細胞等の存在下で培養し、増殖能を有する肝細胞を分離培養した。3ドナー由来の約10回継代可能な肝細胞を分離し、肝細胞特異的タンパク質であるα１‐アンチトリプシンとアルブミンの発現をELISA法で、肝前駆細胞マーカーであるCD44４の発現を免疫染色法で確認した。また、ヒト血清を除去した培養条件下でもヒト肝前駆細胞が増殖する条件を検討し、同様にCD44の発現を調べた。得られたヒト肝前駆細胞を用いて、ウシ内皮細胞、ヒト内皮細胞とそれぞれ混合培養と積層培養を行い、肝特異的マーカーの発現を肝前駆細胞単独培養と比較した。
今後は、3次元肝複合組織体の構築を行い、薬物代謝酵素やトランスポーターの発現についてリアルタイムPCRを用いて定量し、薬物代謝酵素活性について特異的基質を用いて測定する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

これまでヒト血清を用いて培養を行っていたヒト肝前駆細胞について、より簡便に培養するためにヒト血清を除去した培養条件を検討し直した。これについて想定以上の時間を要したため。

Strategy for Future Research Activity

肝小葉の立体構造を模倣した培養系を構築し、肝細胞機能を保持しているかどうか評価を行う。培地中へのアルブミン分泌量をELISA法で測定し、肝前駆細胞単独培養と比較する。また、薬物代謝酵素遺伝子の発現をPCRアレイ法により測定し、肝前駆細胞単独培養と比較する。さらにシトクロムP450の発現を、特異的基質を用いて測定する。

Causes of Carryover

研究が予定よりやや遅れたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

当初の計画通り、必要消耗品の購入に使用する計画である。