2013 Fiscal Year Research-status Report
膵β細胞の再生増殖におけるヒトREGファミリー遺伝子の役割の解明
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25860220
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
山内 晶世 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (70361110)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 再生増殖因子 |
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| Research Abstract |
膵β細胞の傷害時に発現する増殖因子としてラットで発見されたReg (Regenerating gene) 遺伝子は，ヒトでは５種類 (REG Iα, REG Iβ, REG III, HIP/PAP, REG IV) から成るREG family として存在するが，どのREG遺伝子がヒト膵β細胞の再生増殖に重要かは不明である．本研究の目的は，５つのヒトREG遺伝子の膵β細胞における発現と機能の解明である．
平成25年度では，ヒト膵β細胞の培養細胞1.1B4細胞において，REG Iα 遺伝子が炎症性サイトカインのIL-6と抗炎症ホルモンのグルココルチコイド（デキサメサゾン，Dx）の同時刺激によって転写誘導される機構を解明した．レポーターアッセイとゲルシフトアッセイによりJAK/STAT経路の関与が示唆されたので，クロマチン免疫沈降を行い，IL-6/Dx刺激によって転写因子STAT3のREG Iαプロモーターへの結合が増加することを明らかした．
REG Iα遺伝子の転写活性のIL-6/Dxによる増幅率は約10倍であったが，その他の傷害性刺激で同程度まで増幅させるものはなかった．また，REG Iα遺伝子以外のREG family遺伝子は，IL-6/Dxをはじめ，どの刺激によっても顕著に転写誘導されることはなかったので，ヒト膵β細胞の傷害時に発現が増加して再生増殖に働くのは，主にREG Iα遺伝子であると考えられた．
REG Iα遺伝子の誘導効率が低いと糖尿病リスクが高まる可能性があるので，IL-6/Dx刺激による誘導に対する一塩基多型(SNPs)の影響を調べた結果，-563G/A，-10T/Cについては，マイナーアレルである -563A, -10Cで転写活性が2割ほど低下すること，-1166G/C, -1087T/C, -537A/Cについてはアレルによる差はないことを見出した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
REG Iα遺伝子はIL-6/Dxによって著しく転写誘導されるが，その他のREG family遺伝子はIL-6/Dxをはじめ検討した炎症性刺激や膵β細胞傷害性物質による刺激では大幅な転写誘導は見られなかったことから，ヒト膵β細胞の再生において重要なREG遺伝子はREG Iα遺伝子であることが明らかとなった．さらに，IL-6/DxによるREG Iα転写誘導はJAK/STAT経路に依存しており，IL-6/DxはSTAT3のREG Iαプロモーターへの結合を増加させることを初めて明らかにした．
また，REG Iα遺伝子プロモーターのSNPsがIL-6/Dxによる転写誘導に与える影響を解析し，-563G/A，-10T/Cのマイナーアレルで転写活性が減弱することを明らかにした．実施計画では，遺伝子型判定系を構築し，健常者と糖尿病患者のDNAを収集してアレル頻度を解析する予定であったが，IL-6/Dxによる増幅率のアレル間の差が約２割と小さかったので，IL-6/Dxの濃度を変えてアレルによる転写活性の差が顕著になるように条件を最適化したうえで，DNAを解析するに値するかどうか判断する必要がある．
したがって，本研究で目的としていた，膵β細胞の再生に重要なREG遺伝子の特定と転写機構の解明については達成することができたが，REG Iα遺伝子プロモーターのSNPsの解析についてはアレル間の転写活性の差を認めるにとどまっているため，実施計画よりやや遅れている．
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| Strategy for Future Research Activity |
膵β細胞に傷害性刺激を与えたときに，REG Iα遺伝子以外のREG遺伝子の大幅な転写誘導は見られなかったので，今後はREG Iα遺伝子に着目して研究を推進する．IL-6/Dxによる転写誘導に対するSNPsの影響については，誘導率の２割程度の差では，健常者と糖尿病患者のアレル頻度を比較するためには不十分と考えられるので，誘導条件の最適化を図る．IL-6とDxの濃度を変化させてREG Iα遺伝子の転写活性を測定し，アレルによる差が最大となる濃度条件を見出す．アレルによる差が十分大きくなれば，アレル特異的プライマーを用いたPCR法またはPCR-RFLP法によって遺伝子型を判定する系を構築する．もしアレル間の差が十分でなければ，プロモーターの他のSNPsについても検討する．ヒトゲノム・遺伝子解析研究倫理審査委員会で計画実施の承認を受けたうえで，同意の得られた糖尿病患者と健常者のDNAを収集する．健常者と糖尿病患者の遺伝子型を決定し，アレル頻度を比較する．また，糖尿病患者についてはアレル頻度と臨床データ（発症年齢，罹病期間，BMI，糖化ヘモグロビン値，C-ペプチドなど）との関連を解析する．
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
REG Iα遺伝子以外のREG family遺伝子については，膵β細胞傷害性刺激による大幅な発現誘導が見られなかっため，転写誘導機構の解明や機能評価を行う必要がなくなったため．
また，REG Iα遺伝子については，プロモーター領域のSNPsがIL-6/Dxの転写増幅率に大きな影響を及ぼさなかったので，糖尿病患者と健常者のDNAを調べてアレル頻度を解析する段階に進むことができなかったため．
IL-6とDxの濃度を変化させてREG Iα遺伝子の転写活性を測定し，アレル間の差が最大となるように誘導条件を最適化する．対象SNPsの遺伝子型判定系を構築し，糖尿病患者と健常者のDNAを収集してアレル頻度を解析する．次年度使用額は，これらの解析に必要な試薬および消耗品の購入に充てる．
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[Journal Article] Involvement of autoimmunity to REG, a regeneration factor, in patients with primary Sjogren's syndrome.2013
Author(s)
Yoshimoto K, Fujimoto T, Itaya-Hironaka A, Miyaoka T, Sakuramoto-Tsuchida S, Yamauchi A, Takeda M, Kasai T, Nakagawara K, Nonomura A, Takasawa S.
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Journal Title
Clin. Exp. Immunol.
Volume: 174
Pages: 1-9
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Expression of REG III and prognosis in head and neck cancer.2013
Author(s)
Masui T, Ota I, Itaya-Hironaka A, Takeda M, Kasai T, Yamauchi A, Sakuramoto-Tsuchida S, Mikami S, Yane K, Takasawa S, Hosoi H.
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Journal Title
Oncol. Rep.
Volume: 30
Pages: 573-578
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Prevention of Reg I-induced β-cell apoptosis by IL-6/dexamethasone through activation of HGF gene regulation.2013
Author(s)
Nakagawa K, Takasawa S, Nata K, Yamauchi A, Itaya-Hironaka A, Ota H, Yoshimoto K, Sakuramoto-Tsuchida S, Miyaoka T, Takeda M, Unno M, Okamoto H.
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Journal Title
Biochim. Biophys. Acta-Molecular Cell Research
Volume: 1833
Pages: 2988-2995
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Pancreatic β cell proliferation by intermittent hypoxia via up-regulation of Reg family genes and HGF gene.2013
Author(s)
Ota H, Itaya-Hironaka A, Yamauchi A, Sakuramoto-Tsuchida S, Miyaoka T, Fujimura T, Tsujinaka H, Yoshimoto K, Nakagawara K-I, Tamaki S, Takasawa S, Kimura H.
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Journal Title
Life Sci.
Volume: 93
Pages: 664-672
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Dysfunction and proliferation of pancreatic beta cells by intermittent hypoxia.2013
Author(s)
Ota H, Itaya-Hironaka A, Yamauchi A, Sakuramoto-Tsuchida S, Takeda M, Fujimura T, Tsujinaka H, Tsuchida C, Tamaki S, Takasawa S, Kimura H.
Organizer
World Diabetes Congress 2013
Place of Presentation
Melbourne, Australia
Year and Date
20131202-20131206
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[Presentation] Induction of REG Iα, a new auto-antigen in Sjogren’s syndrome patients, in salivary duct epithelial cells by interleukin-6 and -11.2013
Author(s)
Fujimura T, Fujimoto T, Itaya-Hironaka A, Miyaoka T, Yoshimoto K, Sakuramoto-Tsuchida S, Yamauchi A, Tsujinaka H, Tanaka Y, Takasawa S.
Organizer
Annual European Congress of Rheumatology EULAR 2013
Place of Presentation
Madrid, Spain
Year and Date
20130612-20130615
