2014 Fiscal Year Research-status Report

肺腺癌進展におけるnon-coding RNAの解析

Research Project

Project/Area Number	25860275
Research Institution	Jichi Medical University
Principal Investigator	吉本多一郎自治医科大学, 医学部, 助教 (20634166)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2017-03-31
Keywords	non-coding RNA / EMT / 肺腺癌
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的は、肺腺癌進展、特に上皮間葉転換（Epithelial-Mesenchymal transition, 以下EMT）におけるnon-coding RNA (以下ncRNA)の役割を解析することである。昨年度までは、当研究室の保有する肺腺癌細胞株を用いて、EMT形質を示さない高分化群とEMT形質を示す低分化群の網羅的発現解析を行った。使用した肺腺癌細胞株は、高分化群（Bronchial epithelial phenotype）腺癌細胞株8株と、低分化群（EMT phenotype ）腺癌細胞株7株である。これらの細胞株から抽出したtotal RNAを、並列型シーケンサーを用いてncRNA分画のトランスクリプトームシーケンシング行い、網羅的に発現を解析した（これは、共同研究者の東京医科歯科大学ゲノム病理学分野教授の石川俊平氏に依頼した）。その結果、高分化群で（低分化群と比較して）2倍以上高発現していたncRNAが約250個、10倍以上高発現していたncRNAは約50個みられた。逆に低分化群で（高分化群と比較して）2倍以上高発現していたncRNAが約240個、10倍以上高発現していたncRNAは約50個みられた。現在これら両群で発現に差がみられたncRNAのうち、重要度の高いncRNAをその生物学的な働きに着目し、20個程度に絞り込み中である。最終年度は、絞り込んだncRNAについて、shRNAによるKnock Down、あるいはベクターを用いた強制発現により、以下のような機能解析を行う予定である。 (A) In vitroにて、細胞増殖、apoptosis, invasion assay等を行う。 (B) In vivo での効果は、NON/SCIDマウスへの皮下あるいは胸腔内での移植により解析する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 肺腺癌細胞株を用いたnon-coding RNAの発現解析は、順調に進んだが、その結果得られたデータの解析に時間がかかっている。理由としては、解析の結果絞り込んだnon-coding RNAの数が想定よりも多く、個々のnon-coding RNAについて、既報の機能解析情報を把握する作業に時間がかかっているためである。
Strategy for Future Research Activity	今後は、解析結果をもとに、有望なnon-coding RNAについて、shRNAによるKnock Down、あるいはベクターを用いた強制発現により、以下のような機能解析を行う予定である。 (A) In vitroにて、細胞増殖、apoptosis, invasion assay等を行う。 (B) In vivo での効果は、NON/SCIDマウスへの皮下あるいは胸腔内での移植により解析する。さらに、凍結肺腺癌組織についても、これらのnon-coding RNAの発現に実際に差があるか解析を進める。この際、組織亜型、分化度、核異型などの組織学的解析も併せて行う予定である。また、肺腺癌組織でのEMT形質はE-cadherinの免疫染色により評価する予定である（CK7, MUC1の染色も行い参考にする）。さらに、長鎖non-coding RNAの発現に差が見られた場合は、それらがこれまで報告されてきたようにヒストン修飾により起こっているものであるのか、Dlx2 family、HOX familyのpromoter領域のヒストン修飾をCHIP法により部位特異的に検討する予定である。
Causes of Carryover	研究計画が遅れており、最も経費が必要と思われた以下の実験がまだ行われていないため。
Expenditure Plan for Carryover Budget	最終年度は、shRNAによるKnock Down、あるいはベクターを用いた強制発現により、次の機能解析を行う予定である。(A) In vitroにて、細胞増殖、apoptosis, invasion assay等を行う。(B) In vivo での効果は、NON/SCIDマウスへの皮下あるいは胸腔内での移植により解析する。さらに、長鎖non-coding RNAの発現に差が見られた場合は、Dlx2 family、HOX family等のpromoter領域のヒストン修飾をCHIP法により部位特異的に検討する予定である。これらの実験を遂行するうえで試薬や抗体を含めたかなりの経費が必要になり、最終年度まで持ち越しとなった。