肺腺癌進展におけるnon-coding RNAの解析

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25860275
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 吉本 多一郎 自治医科大学, 医学部, 講師 (20634166)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: non-coding RNA / EMT / 肺腺癌

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、肺腺癌進展、特に上皮間葉転換（Epithelial-Mesenchymal transition, 以下EMT）におけるnon-coding RNA (以下ncRNA)の役割を解析することである。
昨年度までは、肺腺癌細胞15株（上皮型細胞株10株、間葉型細胞株5株）から抽出したtotal RNAを、並列型シーケンサーによりncRNA分画のトランスクリプトームシーケンシングを行い、網羅的に発現を解析した（これは、共同研究者の東京医科歯科大学ゲノム病理学分野教授の石川俊平氏に依頼した）。
その結果、上皮型細胞株で間葉型細胞株よりも2倍以上高発現していたncRNAが約250個、10倍以上高発現していたncRNAは約50個みられた。逆に間葉型細胞株で上皮上皮型細胞株よりも2倍以上高発現していたncRNAが約240個、10倍以上高発現していたncRNAは約50個みられた。さらにこれらの中から、ある程度の発現量が期待でき、かつ、細胞株間であまり偏りのないncRNAを一定の基準で絞り込んだ。その結果、上皮型で高発現しているncRNAが8個、間葉型で高発現しているncRNAが6個みられた。これらの中には、現在までにその機能がよく知られていないncRNAや、近年注目されているncRNAなども含まれている。最終年度に当たる今年度では、まずTaqMan Real-Time PCR法により、各細胞株におけるこれらのncRNAの発現量を測定する。この結果、有力な候補と思われるncRNAについてはRNAiによるKnock Down、あるいはベクターを用いた強制発現により、細胞増殖、apoptosis, invasion assay等の機能解析を行う予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

肺腺癌細胞株を用いたnon-coding RNAの発現解析は、順調に進んだが、その結果得られたデータの解析に時間がかかってしまった。その理由としては、解析の結果絞り込んだnon-coding RNAの数が想定よりも多く、個々のnon-coding RNAについて、既報の機能解析情報を把握する作業に時間がかかったためである。
今後は候補となるnon-coding RNAがある程度絞られたため一気に実験を進めていきたい。

Strategy for Future Research Activity

今後は、解析結果をもとに、有望なnon-coding RNAについて、RNAiによるKnock Down、あるいはベクターを用いた強制発現により、細胞増殖、apoptosis, invasion assay等の機能解析を行う予定である。
さらに、外科切除検体数十例をE-cadherin, Vimentin, CK7, Muc1, TTF-1などのマーカーで免疫組織化学的に解析し、これらを上皮型と間葉型に分類する。当研究室でストックされたこられの凍結肺腺癌組織を用いて、候補non-coding RNAの発現に差があるか解析を進めたい。また、予後や組織亜型との相関など臨床病理学的な解析も併せて行いたい。

Causes of Carryover

non-coding RNAの選定に想定以上に時間がかかり、最も予算が必要な機能解析および免疫染色等の試薬を購入していないため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

最終年度は前述のとおり、機能解析を行うためRNAi実験によるknock downやベクターを用いた強制発現の試薬が必要となる。また外科材料を用いた免疫染色も行う場合は各種抗体も必要となるため、これらに使用する予定である。