ウイルスセンサータンパク質RIG-I下流の新規シグナル伝達経路の探索

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25860337
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 高橋 清大 京都大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (90399965)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 自然免疫 / IPS-1 / インターフェロン

Research Abstract

本プロジェクトの趣旨は、ウイルスセンサータンパク質RIG-Iの下流分子であるIPS-1のシグナル伝達機構の解明であった。様々なIPS-1の変異体を用いて、哺乳細胞に恒常的に発現させ、インターフェロン誘導、マイクロアレイによる解析を行ったが、変異体間の大きな変化は見られなかった。そこで、研究を遺伝子組み換えタンパク質を用いた機能解析に変更し、17種類の変異体IPS-1を作成し、分析ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、解析を行った。
IPS-1は通常可溶性には発現しないため、我々が以前のプロジェクトで開発したGRPタグをアミノ末端に融合させることで、可溶性タンパク質として大腸菌を用いて発現することに成功した。IPS-1はアミノ末端にCARDと呼ばれるドメインを持っており、その他の領域はカルボキシ末端に存在するミトコンドリアに局在するための膜貫通へリックス以外、構造を持たない領域であることが明らかとなっている。本プロジェクトでは手始めに、GRP融合CARD、GRP融合全長IPS-1(膜貫通へリックスは除去）を作成した。その結果、CARDのみでは分析ゲル濾過クロマトグラフィーでは極めて大きな多量体を形成していることが明らかとなった。一方全長IPS-1は単量体として存在していた。このため、CARDのカルボキシ末端に多量体化を阻害する領域が存在していると予測した。これは以前の研究から、IPS-1はシグナル伝達を受けるとCARDを用いて繊維状の多量体を形成するという観点からも支持される。そこで、17種類の変異体を作成したところ、構造を持たない領域の一部で種間のホモロジーの極めて高い領域をCARDに直接融合させたところ、単量体を形成することが明らかとなった。
本研究ではIPS-1内に多量体化を抑制する領域を発見した、今後はX線結晶構造解析などでそのメカニズムを明らかにしていきたい。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

複数のIPS-1変異体を作成し、遺伝子組み換えタンパク質として発現させることで、IPS-1の活性化に必要な多量体化を制御する領域を発見することができた。

Strategy for Future Research Activity

現在はIPS-1をGRP融合タンパク質として発現し、機能解析を行っている。本研究ではすでに最少領域の自己阻害型IPS-1について同定しており、X線結晶構造解析により構造決定を行い、機能を決定したい。そのために、より構造解析に適したベクターへの載せ替えを行うところからはじめたい。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

次年度に研究計画に必要な液体クロマトグラフィーを購入するため。
液体クロマトグラフィーの購入