2014 Fiscal Year Annual Research Report
E型肝炎ウイルスの複製機構に関与する5'非翻訳領域の構造と機能に関する研究
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25860344
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| Research Institution | Jichi Medical University |
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Principal Investigator |
小林 富成 自治医科大学, 医学部, 助教 (00634164)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | E型肝炎ウイルス / 5'非翻訳領域 / リアルタイムRT-PCR法 / ウイルス複製 / リバースジェネティクス法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
E型肝炎ウイルス(HEV)はE型肝炎の原因となる1本鎖(＋鎖)RNAウイルスである。昨年度の研究により5’UTRの二次構造がHEVの増殖に重要な役割を果たしていることが明らかになった。本年度は6塩基対のステム構造(nt 4-9：nt 14-19)の種々の変異体を構築し、HEV増殖におけるステム構造の機能をより詳細に検討した。
HEV感染性cDNAクローン(pJE03-1760F)を用いて、5’UTRの6塩基対のステム構造の二次構造を維持させたまま塩基を置換してGCペア数を変えた変異体と、2塩基ずつ置換して塩基対や二次構造を壊した変異体を構築し、それぞれの変異体に対応する全長RNAをPLC/PRF/5細胞にtransfectして増殖効率への影響を検討した。
ステム構造のGCペアが4つの野生型と比較すると、GCペアが3つの変異体は増殖効率が1/6に、GCペアが2つの変異体は1/20に低下した。6塩基対を全てGCペアにした変異体は予想に反し、野生株以上の増殖効率を示すことはなかった。次に、2塩基ずつ変えて塩基対を形成できないようにした変異体を6種類構築して検討した結果、中央の2塩基対を置換した変異体では増殖は認められず、他の変異体でも増殖効率は明らかに低下した。変異体のウイルスタンパク質(ORF2, ORF3)の細胞内発現レベルをIFA法により定量的に検討した結果、培養上清中のHEV RNA titerとほぼパラレルな関係にあることが分かった。
以上のように、5’UTRのステム構造を維持したままGCペア数を変化させるとHEVの増殖効率が低下したことから、野生株が保有している5’UTRの構造及び塩基配列がHEVにとって最も適しているものと考えられた。また、ステム構造の中でも中央の2つのGCペアがウイルスの複製において特に重要な役割を果たしていることが示唆された。
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