Real-time imaging of cell penetrating peptide (CPP) in the cytosol

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25860400
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 奥田 明子 (田所明子) 新潟大学, 医歯学系, 助教 (60454584)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: CPP / ドラッグデリバリー / エンドサイトーシス

Outline of Annual Research Achievements

膜透過性ペプチド（CPP）を用いたドラッグデリバリーにおいて、その主な細胞内導入経路はエンドサイトーシスであることから、サイトゾルへの移行効率の向上が課題であった。本課題では昨年度までに、アルギニンペプチド（R12）へと付加することでタンパク質や抗体などの高分子を高効率でサイトゾルへと移行させることができる配列（mPas）を見出していた。
本年度はR12-mPasを用いて、HEK293細胞においてR12-mPasによる高分子（EGFP）のサイトゾルへの導入メカニズムについて解析を行った。アジ化ナトリウム存在下や低温条件下では、サイトゾルへの拡散が阻害されることが分かった。よって、細胞のエネルギー依存的にサイトゾルへと拡散していることが分かった。また、エンドサイトーシスの一種であるマクロピノサイトーシスの阻害剤として使用されるEIPAで細胞を処理したところ、サイトゾルへの拡散は阻害されなかった。しかし、サトカラシンDによって細胞骨格を構成するアクチンの重合を阻害したところ、サイトゾル拡散が阻害された。よって、R12-mPasによりEGFPはエンドサイトーシスで取り込まれ、アクチン骨格を利用した細胞運動によってサイトゾルへと拡散している可能性が示唆された。現在、これらの結果をまとめ現在学術雑誌へ投稿中である。
また、生細胞内においてR12-mPasによる抗体導入による細胞内小器官へのターゲティングを試みた。ゴルジ体に局在するGiantinを認識する蛍光標識抗体を導入し、ゴルジマーカーとGianitin認識抗体が共局在している様子が共焦点レーザー顕微鏡観察により確認することができた。