アデノ随伴ウィルスベクターを用いた神経障害性痛に対する遺伝子治療

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25860423
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 小幡 典彦 神戸大学, 医学部附属病院, 助教 (30509443)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 慢性痛 / 神経障害性痛 / 脳由来神経栄養因子 / アデノ随伴ウィルスベクター / siRNA

Research Abstract

【BDNFエクソン1 mRNAに対するsiRNAのデザイン】
これまでの研究により、痛みモデルではBDNFのエクソン1を含むmRNAが増加することが分かっている。BDNFエクソン1に対する効果的なsi-RNA配列は、コンピュータアルゴリズムにより有効と予測される3種類の配列のsiRNAをデザインした。
【神経障害性痛動物モデルの作成】
Wistarラットに対して、麻酔下に背部の皮膚を切開後、L6の横突起周囲を丁寧に剥離後切断し、第5腰神経を5-0絹糸にて神経を結紮した。その後、くも膜下に薬剤注入用の、PE10カテーテルを挿入した。止血を確認して閉創した。この処置によって、術後2日目から数週間持続する痛覚過敏状態が観察された。
【投与経路の確認】
腰椎レベルからのくも膜下投与により、腰椎レベルでの後根神経節にベクターが入りこんでいることを確認した。さらに、胸椎レベルの後根神経節や脳では検出されないことも確認できた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

所属の異動があり、in-vitroの実験に関してはやや遅れが生じた。次年度に予定していた疼痛モデルの確認を前倒しして行うことで、速やかに遅れが取り戻せるよう準備した。

Strategy for Future Research Activity

まず培養DRG細胞を使用し、in-vitroでのBDNF発現抑制効果の確認を行う。さらに、in-vivoでAAVベクターくも膜下投与後5－6週に組織（DRG、脊髄）を摘出し、ウィルス感染のモニタリングとなるGFPの発現、及びBDNFの発現抑制を確認する。定量PCRにてmRNAの変化を、ウエスタンブロット法にてタンパク質の変化を確認する。疼痛行動評価は、機械刺激によるアロディニアを測定する。具体的にはvon Frey filamentを用いて両側ラット足底を刺激し、その逃避反応から50％逃避閾値を測定する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

試薬の一部が予定より安価で入手できたため、39,889円の余剰が生じた。
平成26年度分に合算して使用する予定である。