造血幹細胞におけるTieシグナルの解析とTie1のリガンド同定

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25860799
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 百瀬 暖佳 国立感染症研究所, その他部局等, 研究員 (70415488)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 造血細胞 / 受容体型チロシンキナーゼ

Research Abstract

造血幹細胞は未分化性と多分化能を兼ね備えた血球系の幹細胞であり、その機能を維持する分子の一つとして受容体型チロシンキナーゼTie2が同定されている。同じTieファミリーに属するTie1も同様の機能を持つと考えられているが、ノックアウトマウスの表現型の違い等から独自の機能を有している可能性が示唆される。本研究課題では、オーファン受容体であるTie1のリガンド同定も含めたTie1の機能解析を行うことを目的としている。
平成25年度は、SST-REX法により見出された候補分子がTie1リガンドとして機能するかどうかの検討を行った。スクリーニングにはヒト細胞のcDNAライブラリーを用いていたこと、マウスTie1-Fcではリコンビナントたん白質の安定性に問題があったことから、ヒトTie1-Fcをツールとして用いた。候補分子は市販のリコンビナントたん白質等を用い、ヒトTie1-Fcによるファーウェスタンブロッティング、および免疫沈降実験を行ったが、いずれも相互作用は検出されなかった。
リガンド候補分子は、Tie1-Fcと安定な複合体を形成できなくても、Tie1の活性化状態に影響を及ぼす可能性が考えられるため、Tie1発現細胞への添加効果を検討することとした。細胞は、抗体等の解析ツールが充実していることから、当初予定していたマウス由来細胞ではなくヒト由来細胞に変更した。リアルタイムPCR法、およびウェスタンブロット法で内在性Tie1の発現が検出できる血球細胞を探索し用いた。コントロールとしてTie2の発現確認も行い、よりTie2の発現が低いものを選択した。現在、リガンド候補分子の添加効果を検討中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成25年度は所定の業務に加えて予定していなかった依頼業務が多数あり、まとまった時間を確保することが困難であったために当初の計画よりやや遅れ気味である。平成26年度は、これまで担ってきた業務の一部振り分けが期待されるため、当該研究の遂行に努めたい。

Strategy for Future Research Activity

現在リガンド候補分子の添加効果を検討中であるが、リガンド添加・インキュベーション操作によりTie1の発現低下が認められ、明確な結果が得られていない。Tie1の発現低下の原因としては、分解促進、不溶化画分への移行等が考えられる。今後はTie1のN末端、またはC末端を認識する抗体によって分解産物の検討を行い、分解が検出された場合は、より分解されにくい条件でのリガンド添加実験を検討する。不溶化画分への移行については、刺激後の細胞を分画し、各画分におけるTie1量、リン酸化状態をウェスタンブロット法で確認する。同様に、同じ画分に候補分子が共局在するかも検討したい。
また、リガンドが同定できなかった場合でも血液細胞におけるTie1下流のシグナル伝達を解析するため、Tie1のconstitutively active体、dominant negative体を構築する予定である。これらが期待される活性化状態を示す事を確認した後、下流のシグナル分子の動態について検討を進めていきたい。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

交付額と実支出額に差異が生じるのは致し方ないことであり、余剰金額は2,667円と僅少のため特段の問題ではないと考える。次年度に繰り越さずに返納する。
次年度に繰り越さず返納する。