2013 Fiscal Year Research-status Report
LAMP法によるリケッチア感染症の新規迅速診断法の確立
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25860828
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Shimane University |
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Principal Investigator |
新原 寛之 島根大学, 医学部, 講師 (60362935)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | リケッチア感染症 / 日本紅斑熱 / ツツガムシ病 / LAMP法 |
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| Research Abstract |
平成25年度は，3例のリケッチア感染症疑い例を検査し，1例でPCR法により日本紅斑熱陽性を認めた。当該検体につき，17kDa抗原領域の遺伝子配列を解析し系統樹解析を施行したところ，従来の日本紅斑熱とは異なる遺伝子配列が確認された。後日，馬原アカリ医学研究所にて，日本紅斑熱（Rickettsia japonica: R. japonica），発疹熱（R. typhi），ツツガ病（Gilliam型，Karp型，Kato型，Irie (=Kawasaki) 型，Hirano (=Kuroki) 型，Shimokoshi 型），日本紅斑熱以外の紅斑熱（R. bellii-like，R. canadensis，R. helvetica，R. tamurae），発疹チフス（R. prowazekii）および重症熱性血小板減少症候群（severe fever with thrombocytopenia syndrome virus: SFTS virus）に対する抗体検査を行ったが，どれも陰性であった。本邦におけるリケッチアは多くがツツガムシ病、日本紅斑熱で占められるが、自験例のように新規リケッチア感染症と疑われるものや、世界中の物流の拡大で輸入感染症として実臨床上で経験される可能性があるためその対応も今後必要である。
また，loop-mediated isothermal amplification: LAMP法の確立を目的として，プライマーの設計を行った。材料は，平成23年度より当大学で同定した日本紅斑熱患の臨床検体より抽出したDNAを使用した。現段階では感度は良いが反応時間が長いため迅速診断にに適するよう，プライマーの改良を進めている。新規にLAMP法による検査法を確立すれば、1検体の検査に要する実費用は人件費を含めず約3000円と見積もられる。費用の安さも実臨床上有用である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成25年度，島根県においてリケッチア感染症疑い検体は3例あり，このうち1例が日本紅斑熱であることが判明した。この症例数は，当該研究を申請した平成24年度において日本紅斑熱が6例，ツツガムシ病が4例検出されたことと比較するときわめて少数である。島根県感染情報センターによると，島根県において平成25年度に報告されたリケッチア感染症のうち日本紅斑熱は5例，ツツガムシ病の報告は皆無であり，そもそもリケッチア感染症の頻度が少ない年度であったと考えられた。
リケッチア感染症の早期診断を可能とするLAMP法の確立を目的として，日本紅斑熱ではR. japonicaの17kDa抗原を標的としてプライマーの設計を行った。また，ツツガムシ病については，先行研究で報告されているO. tsutsugamushi の60 kDa heat shock proteinを標的としたプライマーを使用した。テンプレートには，平成23年度より当大学において，従来のPCR法およびreal-time PCR法で陽性かつ系統樹解析でR. japonicaであることを同定した日本紅斑熱患の臨床検体由来のDNAを4検体，および，同様にツツガムシ病患者の検体由来のDNA（Orientsia tsutsugamushi: O. tsutsugamushi Japanese Gilliam型（2），Karp型（1），Shimokoshi型（1））を4検体用いた。日本紅斑熱については，4検体で増幅反応が見られることを確認している。また，ツツガムシ病については，real-time PCR法と同様にShimokoshi型で遺伝子の増幅が確認さなかったものの，他の3検体では増幅が確認された。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度についても，引き続きリケッチア感染症の疑い例につて，従来法による検査（real-time PCR法による迅速診断，PCR法による確認および系統樹解析，抗体検査による確認）を行い，早期診断および病原体の同定に努め，島根県におけるリケッチア感染症の現状を把握する。
さらに，現段階で得られたLAMPプライマーを改良することを目的とする。日本紅斑熱については，現段階で得られたプライマーを用いた増幅反応では反応時間が長く，この点を改良することを目的とする。また，ツツガムシ病については，先行研究のプライマーではShimokoshi株が検出されない可能性があり，この点について対処法を考案することを目的とする。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
島根県において，当該年度（平成25年度）のリケッチア疑い症例の数が例年より少なく，検査に当たり，当該講座の技術補佐員が十分対応できる範囲内であった。同様に，試薬費用等も予定より使用量が少なく，当該年度は必要最小限のみを購入した。
現在，リケッチア感染症疑い患者の臨床検体のLAMP法は，測定装置（Loopamp EXIA, 栄研化学）のある島根大学病院の検査部で行っている。近年，LAMP法の普及とともに，通常の測定装置と比較して極めて安価で汎用性の高い簡易測定装置が開発されている。当該検査装置は，定温反応が±2℃で進むため不安定とされているが，本装置での動作が保証されればLAMP法の汎用性が高まる事が期待される。平成26年度は，本装置での動作を確認することを当初の研究計画に付け加え，当該研究の成果をより高めることを目標とする。
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