なぜバルプロ酸は神経管欠損症を引き起こすか？-葉酸代謝酵素欠損マウスを用いた解析

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25860837
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 菊池 敦生 東北大学, 大学病院, 助教 (30447156)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: エピジェネティクス / 神経管欠損症 / バルプロ酸 / 葉酸代謝

Research Abstract

バルプロ酸は繁用される抗けいれん薬だが、胎児に神経管欠損症を生じるため妊娠可能な女性への投与が制限され、その副作用の機序解明は重要である。最近、研究者らは葉酸代謝に関与するグリシン開裂酵素系遺伝子のノックアウトマウスが高率に神経管欠損症を起こすことを見出した（Hum Mol Genet, 2012）。バルプロ酸はグリシン開裂酵素系を抑制するため、それによるDNAメチル化異常を介してバルプロ酸関連神経管欠損症が発生するとの仮説を立てた。本研究では、このノックアウトマウス胎仔のDNAメチル化状態とmRNA 発現をゲノムワイドに解析し、仮説を検証する。ヘミマウスを掛けあわせ、妊娠マウスより、ノックアウトマウス胎仔とその同腹の野生型胎仔を神経管閉鎖時期である胎生９日頃に取り出してそれぞれの胎仔よりDNA/RNAを抽出、保存した。抽出したDNAより胎仔の遺伝子型を確認し、それぞれの遺伝子型を持つ核酸をプールして次世代シークエンサーによる網羅的DNAメチル化解析に供した。網羅的DNAメチル化解析には微量のDNAで解析可能な手法であるPost Bisulfite Adaptor Tagging (PBAT)法を用いた。出力された配列データをマッピングソフトウエア（Bowtie, Bismark）によりマウスゲノム参照配列にマッピングし、可視化することに成功した。すでに解析したmRNA発現アレイのデータより得られた候補遺伝子におけるDNAメチル化状態をノックアウトマウス胎仔と野生型胎仔で比較し、メチル化サイトごとに有意なメチル化の状態が変化している部位を探索している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

マウス胎仔の網羅的DNAメチル化解析には一定量のDNAが必要である。当初の計画では胎仔DNAをプールしてSureSelect XT Mouse Methyl- Seqによるメチル化に関連するターゲット領域のキャプチャを行った上で次世代シークエンサーでの解析に供する予定であったが、十分な量のDNAが得られなかった。少量のDNAで開始できるPost Bisulfite Adaptor Tagging (PBAT)法を用いて次世代シークエンサーでの解析に成功したが、全ゲノム領域の解析となり、一部の遺伝子で十分な量の情報が得られなかったり、バイオインフォマティクスによる解釈に時間を要したりしている。この影響でバルプロ酸投与下における胎仔の網羅的DNAメチル化解析については進行が遅れている。

Strategy for Future Research Activity

Post Bisulfite Adaptor Tagging (PBAT)法で行った網羅的DNAメチル化解析のバイオインフォマティクスによる解釈をさらに進めて候補遺伝子をさらに絞り込む。また、並行してmRNA発現アレイで変動の見られた候補遺伝子のメチル化についてbisulfiteシークエンスやEpiTYPERによる定量的メチル化解析などで個別に検討を行う。
このほか、遅れていたバルプロ酸投与下のグリシン開裂酵素系ノックアウトマウスでの表現型解析や網羅的DNAメチル化解析も大学院生の協力を得て行う。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

グリシン開裂酵素系ノックアウトマウスでの網羅的DNAメチル化解析に時間を要し、バルプロ酸投与下の神経管欠損症の表現型解析やその網羅的DNAメチル化解析を次年度に延期したことによる。
助成金は延期したバルプロ酸投与下の網羅的DNAメチル化解析や、候補遺伝子のDNAメチル化解析の試薬、マウスの飼育・購入・表現型解析費用、に必要な経費として平成26年度請求額と合わせて使用する予定である。