2014 Fiscal Year Research-status Report
心筋緻密化障害の病態解明－患者血液細胞由来の心筋細胞を用いた機能解析－
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25860848
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
廣野 恵一 富山大学, 大学病院, 助教 (80456384)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 心筋症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①方法：臨床面と基礎研究面の両面から心筋緻密化障害の発症機構の解明するために、まず、心筋緻密化障害の臨床像を検討する。次に、心筋緻密化障害患者において、胎生期における心筋層の発達・成熟に関わる遺伝子異常の探索を行う。さらに、探索された遺伝子異常が心筋の発達・成熟に及ぼす影響を明らかにするために、患者iPS細胞由来心筋細胞を作製し、機能解析を行う。(ⅰ) 患者の臨床像の検討、(ⅱ) 患者血液サンプルの採取および遺伝子解析
② 結果
(ⅰ) 全国調査と臨床像の検討：小児期発症の心筋症の症例に対し、臨床像と遺伝的背景の有無を把握する。特に、家族性の有無、他の心筋症の有無、致死的不整脈や突然死の有無について検討を行った。
(ⅱ) 患者血液サンプルの採取および遺伝子解析：検体を用いた遺伝子解析はすでに富山大学研究倫理委員会の承認を受けている（受付番号：遺伝子24-2）。血液検体からDNAを抽出し次世代シーケンサーにて遺伝子異常の有無を検討した。その結果、2家系からサルコメアの2遺伝子異常が明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
以下の方法：
(ⅰ) 患者の臨床像の検討
(ⅱ) 患者血液サンプルの採取および遺伝子解析
(ⅲ) 患者血液サンプルからのiPS細胞の樹立およびiPS細胞から心筋細胞への分化誘導
(ⅵ) 患者iPS細胞由来心筋細胞の分化能および増殖能の評価、電気生理学的機能測定
に関して、(i),(ii)に関しては到達したが、(iii),(iv)に関してはまだ到達していないため。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の課題：患者iPS細胞由来心筋細胞の機能評価
(ⅰ) iPS細胞由来心筋細胞の分化能評価 ：野生株と患者由来株の間で分化能および形態的な表現において差異を生じるか、遺伝子発現レベルおよび蛋白の発現レベルを評価する。遺伝子発現レベルはreal-time RT-PCRにて野生株と患者由来株iPS細胞由来心筋細胞のTnnTやNKX2.5などの心筋特異的mRNAの発現を比較検討する。蛋白の発現レベルは免疫蛍光染色およびウェスタンブロット法にて野生株と患者由来株iPS細胞由来心筋細胞のTnnTやNKX2.5などの心筋特異的蛋白の発現を比較検討する。
(ⅱ) iPS細胞由来心筋細胞の増殖能およびアポトーシスの評価：野生株と患者由来株の間で増殖能およびアポトーシスに差異を生じるか、Flow cytometry法と免疫組織染色を行い評価する。増殖能に関しては、iPS細胞由来心筋細胞をBrdUにて数時間培養し、BrdUを取り込ませた上で、細胞を回収し、抗BrdU抗体を用いて、BrdU陽性細胞と非BrdU陽性細胞の比率を算出し、野生株と患者由来株間で比較検討する。アポトーシスに関しては、TUNEL法を用いて、免疫染色を行い、野生株と患者由来株間で差異がないか比較検討する。
(ⅲ) iPS細胞由来心筋細胞の電気生理学的機能測定：パッチクランプ増幅器と倒立顕微鏡を用いてiPS細胞由来心筋細胞からパッチクランプ法記録を行い、野生株と患者由来株の電気生理学的性質を比較し、催不整脈性の有無を検討する。具体的には静電容量、ナトリウムおよびカリウム等イオンチャネルの電流密度、活性化/不活性化/脱活性化/脱不活性化速度を検査する。また、今回申請する64ch細胞外電位記録システムを用いて活動電位の発火頻度および持続時間を検査する。さらに、iPS細胞由来心筋細胞に蛍光カルシウム・イメージング法を適用し、心筋の収縮能に必要な細胞内カルシウムの動態を野生株と患者由来株で比較する。
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| Causes of Carryover |
研究計画が当初の予想より遅れたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今後は患者iPS細胞由来心筋細胞の機能評価を行う。具体的には(ⅰ) iPS細胞由来心筋細胞の分化能評価、(ⅱ) iPS細胞由来心筋細胞の増殖能およびアポトーシスの評価、(ⅲ) iPS細胞由来心筋細胞の電気生理学的機能測定を行うために消耗品を購入予定である。
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