2013 Fiscal Year Research-status Report
照射後血中オステオポンチンを指標としたHIF-1阻害剤併用放射線治療法の開発
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25861056
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
佐藤 まり子 弘前大学, 医学部附属病院, 医員 (30645263)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 低酸素 / HIF-1a阻害剤 / アポトーシス / ミトコンドリア脱分極 / 活性酸素 |
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| Research Abstract |
腫瘍微小環境における低酸素状態はがん放射線治療の抵抗因子となる。この一端を担うHypoxia-inducible factor-a (HIF-1a) は腫瘍血管増生や再発・転移を促進する。近年開発された薬剤LW6は、HIF-1a蓄積を阻害して低酸素腫瘍の治療抵抗性改善に働くことが期待されるが、詳細な作用についてはまだ不明な点が多い。
そこで本研究では、ヒト肺腺癌A549細胞を用い、LW6を培地中に投与して通常酸素下または低酸素（1% O2）下で培養し、タンパク質定量とアポトーシス解析を行った。HIF-1a発現量をウエスタンブロット法で評価したところ、低酸素に起因するHIF-1a発現はLW6投与で抑制された。また、フローサイトメトリーにてアポトーシス解析を行ったところ、通常酸素下ではLW6投与と非投与でアポトーシス細胞の割合に変化を認めなかったが、低酸素下ではLW6投与により有意に増加した。LW6は低酸素腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することが明らかとなった。
また、LW6は電子伝達系での好気的代謝に関与するリンゴ酸脱水素酵素を阻害することが報告されている。そこで、LW6の好気的代謝阻害によりミトコンドリア由来の毒性が生じるかどうかを検討するため、JC-1染色にてミトコンドリア膜電位を評価した。低酸素曝露はミトコンドリアの脱分極を誘導しなかったが、LW6投与後に低酸素へ曝露すると、脱分極したミトコンドリアを有する細胞の割合はLW6非投与と比べて増加した。通常酸素下ではこのような変化は明らかでなかった。
さらに、細胞内の活性酸素 (ROS) 産生を評価したところ、LW6投与によりROS産生は亢進し、このROS誘導は通常酸素下と比較して低酸素下でより顕著であった。ミトコンドリア由来のROS産生量についても評価を行い、同様の結果を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は、「放射線照射に伴う血中オステオポンチン (OPN) および炭酸脱水素酵素-IX (CA-IX) の変動をもとに低酸素腫瘍組織の存在を同定し、LW6を併用して放射線照射を行うことで、放射線の抗腫瘍効果を高めることができるかを検討すること」である。当初の計画では、これを達成するために必要な研究小課題として、当初、1) 放射線照射の低酸素細胞に対する細胞内ROSレベルへの影響、2) 腫瘍低酸素領域を反映した照射後OPN・CA-IXの血中濃度変化、3) LW6による放射線治療効果への影響、の3つを挙げた。
しかし今回、LW6が低酸素細胞のアポトーシスを誘導することが初めて明らかとなったため、これに関連した実験に特に重点を置いて進めてきた。総合的には、おおむね順調に進行しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究の目的達成のため、①放射線照射によるROSの蓄積に依存してOPNやCA-IX発現が増強する、②腫瘍低酸素領域に依存して照射前後でOPNやCA-IXの血中濃度が変動する、③LW6は放射線治療後の再酸素化によりHIF-1分解を相乗的に促進し，腫瘍の治療抵抗性を減弱させる、という3つの仮説に基づき検討を進めていく。さらに、LW6投与が低酸素腫瘍細胞の放射線治療効果を高めることが期待されるため、これについて検討を加えていく。
まずはin vitroにて、腫瘍細胞を通常酸素下および低酸素下でX線を照射したとき，低酸素下で細胞内ROSの蓄積が増強されることを確認し、HIF-1aおよびOPN、CA-IXの発現を評価する。その後放射線感受性への影響についても検討する。同様にin vivoでの評価も行う。さらに、放射線感受性に対するLW6の作用を明らかにしていく。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
LW6が低酸素腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するという新知見を得たため、これに関連した検討を進めるために前倒し支払請求を行ったが、アポトーシス解析に用いる試薬を思いがけず他の研究室の研究者より譲り受けた。このため、次年度使用額が生じた。
これまでの我々の研究で、LW6が低酸素腫瘍細胞の遊走能及び浸潤能を抑制する効果を示すことが明らかになりつつある。これを確認するため、migration assay及びinvasion assayを行うこととし、これに必要な消耗品の購入に充てる。
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