2014 Fiscal Year Research-status Report
異種細胞間における放射線誘発バイスタンダー効果に関する細胞応答解析
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25861137
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| Research Institution | National Institute of Radiological Sciences |
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Principal Investigator |
小西 輝昭 独立行政法人放射線医学総合研究所, 研究基盤センター, 主任研究員 (70443067)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | バイスタンダー効果 / マイクロビーム / 陽子線 / ギャップジャンクション / 窒素酸化物ラジカル / DNA二本鎖切断 / γH2AX |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、SPICEマイクロビームを用いて（１）がん細胞と正常細胞の共培養条件下（A549-H2BGFP（以下A549GFP）・WI38）、（２）がん細胞のみ（A549GFP・A549）、の二条件について実験を行った。すべての試料においてA549GFP細胞へのみに照射し、照射陽子数は500個とした。照射後1、4、24時間にDNA二本鎖切断（DSB）のマーカーであるγH2AXに対して免疫蛍光染色を行い、取得した蛍光画像をもとに細胞核あたりのγH2AX量を測定した。バイスタンダーWI-38細胞のγH2AX 量は照射後1、4時間後の両方において非照射細胞皿（対照群）に比べて2割程度の増加後24時間後にはほぼ同程度まで下がった。がん細胞のみの条件（２）では、バイスタンダーA549細胞にγH2AXの増加は確認できなかった。また、照射されたA549GFP細胞については、共培養（１）とがん細胞のみ（２）の両方の条件においてγH2AX量は照射後24時間にかけて減少したが、4時間後の共培養（１）はがん細胞のみ（２）の条件と比較して３割高い量を示した。
また、（１）がん細胞と正常細胞の共培養条件下（A549-H2BGFP（以下A549GFP）・WI38）において照射4時間後のA549GFPのγH2AX量はギャップジャンクション(GJ)を阻害するとと2割ほど少なかった。
結果をまとめると、バイスタンダー細胞WI-38細胞が存在する場合、照射されたA549GFP細胞のDSB修復が、A549細胞のみの集団に比べて遅く、また、バイスタンダーWI38細胞へのシグナルもGJを主とした細胞間情報伝達である可能性を示唆した。また、照射A549GFP細胞のDNA修復は、周辺のWI-38細胞密度に依存する可能性があり、そのため、A549GFP細胞のDSB修復がA549細胞のみの集団のものに比べて、高密度でWI38細胞が存在すると遅くなり、逆に低密度であれば速くなるといった結果（平成25年度報告）を得ている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在までに、１）～３）の項目について結果を得た。
１） 細胞核に安定的にH2BGFPを発現するA549GFP株を樹立した。これは、マイクロビーム実験において、異種細胞の共培養条件下で細胞核内GFP蛍光を頼りにA549GFP細胞にのみに照準・照射することを可能した。またソフトウエアによる画像処理・解析の際の照射細胞・非照射細胞の区別を自動化することができ、数千もの細胞数でのデータ解析が可能となった。
２） A549細胞、A549GFP細胞、WI38細胞にギャップジャンクション（GJ）構成タンパク質コネキシン43が発現していることをウエスタンブロット法により確認した。また、GJ機能性について、共焦点レーザー顕微鏡を用いたフォトブリーチ法とスタンポレーション法によるルシファーイエロー色素の細胞間拡散の確認により有効に機能していることを証明した。
３） がん細胞と正常細胞が同一の細胞皿中にて培養されている１）共培養条件（A549GFP・WI38）、２）がん細胞のみ（A549GFP・A549）、３）正常細胞（WI38）のみの３種の試料条件のうち１）と２）について、A549GFP細胞へのみ照射をし、GJ及び培地介在性（MT）経路によるバイスタンダー応答について細胞核内γH2AXを指標にその効果を評価し、ほぼ完了している。
ただし、当初の計画にあったアポトーシス誘発頻度を測定することでバイスタンダー応答による細胞致死誘発の評価については結果が得られていない。一つに、本研究で用いている細胞種のアポトーシス頻度が非常に低く、本研究で採用しているマイクロビーム照射法には、照射可能な細胞数が数千個という技術的な制限があり、そのため統計的な有意差を持って実証する結果は得られていない。
しかし、異種細胞間におけるバイスタンダー応答に関して、細胞核内DSBの指標であるγH2AXを検出する実験系にて、十分に実証できていると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
照射されたA549GFP細胞から非照射のWI38細胞へ何らかの因子が伝達しバイスタンダー効果を示した。また、その逆で、WI38のGJがA549GFP細胞のDSB修復に関与していることも実証した。つまり、バイスタンダーシグナル伝達は、照射細胞から非照射細胞への伝達だけではなく、非照射細胞から照射細胞へとフィードバック伝達が行われていると考えられた。放射線誘発DNA損傷に対して、その修復機構は単一細胞レベルで完結しているわけではなく、その周辺の細胞群との双方向的シグナリングによって誘導されている可能性があるのではないかと考えた。
そこで、本課題の最終年度である平成27年度においては、以下を実験計画とする。
（１）がん細胞と正常細胞が同一の細胞皿中にて培養されている１）共培養条件（A549GFP・WI38）、２）がん細胞のみ（A549GFP・A549）について、A549GFP細胞へのみ照射をし、ギャップジャンクション（GJ）及び培地介在性（MT）経路によるバイスタンダー応答について細胞核内γH2AXを指標に引き続きその効果を評価し、実験データの蓄積を図る。
（２）A549細胞の近傍にいるWI-38細胞も放射線照射された場合、（１）と同様のフィードバックシグナリングが起きるのかについて、検証する。バイスタンダー応答の検出系には、引き続きγH2AXを用いる。
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