EMTを起こした肺癌循環腫瘍細胞のマイクロ流体チップシステムを用いた検出法の開発

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25861251
• Research Institution: University of Occupational and Environmental Health, Japan
• Principal Investigator: 近石 泰弘 産業医科大学, 医学部, 非常勤医師 (70609221)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 循環腫瘍細胞(CTC) / 肺癌 / 上皮間葉転換(EMT) / 上皮接着分子(EpCAM) / CTC-chip

Outline of Annual Research Achievements

循環血液中腫瘍細胞(CTC) の新しい検出方法の確立として、今回、大永らが開発した国産の マイクロ流体チップ“CTC-chip”(Ohnaga T他. Biomed Microdevices 2013等)を用いて、より高感度かつ信頼性の高いCTC検出システムに改良することを目的に研究を行っている。
平成25年度の報告において、上皮細胞接着分子(EpCAM) の発現がない細胞株を用いた“CTC-chip”の基礎実験で、抗Podoplanin抗体を用いることにより、“CellSearch”で行った実験より5倍程度高い回収率が得られたことを報告した。今年度は“CTC-chip”の基礎実験の再現性を中心に行った。細胞株を5% BSA in PBSに懸濁した場合と、健常人の血液に細胞株を懸濁した場合で“CTC-chip”での捕捉実験を行い、細胞の捕捉率の再現性を確認した。昨年度に報告した場合と同様、再現性のあるdataを得ることが出来た。ただし、健常人の血液に細胞株を懸濁した場合は捕捉率がACC-MESO1(EpCAM発現(-))の場合は12.7%、ACC-MESO4の場合は38.4%(EpCAM発現(-))と十分な捕捉率が得られなかった。 “CTC-chip”は基礎抗体として抗マウスIgG、捕捉抗体としてマウス抗ヒト抗体を使用し、2段階で抗体のcoatingを行う。今回、十分な捕捉率を得るために、抗体濃度の調製を行った。具体的には、捕捉抗体である抗podoplaninの濃度をそのまま(20μg/ml)にして、基礎抗体である抗マウス抗体の濃度を10倍にした(20μg/ml→200μg/ml)。その条件で再度捕捉実験を行うと、健常人の血液に細胞株を懸濁した場合は捕捉率がACC-MESO1の場合は37.9%、ACC-MESO4の場合は83.1%と十分な捕捉率を得ることが出来た。現在使用している“CTC-chip”において、抗体の濃度が、細胞の捕捉に大きく影響することが判明した。来年度は複数抗体を用いて、細胞の回収率を検討し、さらには、実際の臨床検体のdataの蓄積をすることを目標としたい。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

“CTC-chip”の捕捉性能の再現性の実験を行うことが出来た。捕捉の性能は再現性のあるdataが得られた。また、基礎になる抗体の濃度を上げることで、捕捉率が上がることが判明し、血液を懸濁させた際に十分な捕捉率を得ることが出来た。今後は捕捉する抗体の種類を増やして、実験を行っていき、さらなる性能の向上につなげていく必要がある。

Strategy for Future Research Activity

EGFRやHER2などの抗体を用いてCTC-chipでの捕捉が可能かを検証し、再現実験を行い、捕捉効率を検証。十分な結果が得られれば、複数抗体のcoatingを行い、より性能の高いCTC-chipの検出法の確立を目指す。さらに、臨床検体でのdataを蓄積し、実際の臨床現場にCTCのdataを還元できるようなシステムを構築していきたい。

Causes of Carryover

循環腫瘍細胞を捕捉するためのマイクロ流体デバイスであるCTC-chipを使用した研究を行っているが、現在は様々な抗体を使用しての捕捉を試みている。
直近ではEGFRの抗体を追加で購入して、捕捉が可能なこと確認した。さらに複数の抗体を購入して捕捉実験を行う予定であったが、使用する抗体の選定に時間がかかり、次年度に持越しとなっている。

Expenditure Plan for Carryover Budget

今後の使用計画としては、抗体の購入や、CTC-chipの購入などに費用を使う予定である。

Research Products

• [Presentation] Comparison of CellSearch with polymeric microfluidic devices for CTC isolation using EpCAM-negative tumor cell lines of malignant pleural mesothelioma (2014)
  • Author(s): Yasuhiro Chikaishi1), Tomoko So1), Masaru Takenaka1), Soichi Oka1), Ayako Hirai1), Takashi Iwanami1), Kazue Yoneda1), Hidehiko Shimokawa1), Yoshika Nagata1), Hidetaka Uramoto1), Takeshi Ohnaga2), and Fumihiro Tanaka1)
  • Organizer: AACR meeting
  • Place of Presentation: San Diego CA(USA)
  • Year and Date: 2014-04-05 – 2014-04-09