精子幹細胞の機能解析による造精機能障害の発症メカニズムの解明と不妊治療への応用

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25861436
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 阪野 里花 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (20600753)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 精子幹細胞 / 造精機能障害 / 男性不妊症

Outline of Annual Research Achievements

本研究は精子幹細胞（spermatogonial stem cell; SSC）の機能解析を行い、初期精子形成の機序を明らかにすることで男性不妊症の治療成績を向上させるための研究である。実際には私たちがこれまでに開発してきた造精機能障害モデル動物（停留精巣ラット）とヒト停留精巣検体を用い 、精子幹細胞関連遺伝子の発現異常と造精機能および妊孕性への影響を検討している。
これまでに研究１．「造精機能障害における精子幹細胞活性の検討」、研究２．「造精機能を制御する遺伝子群の検討」を行ってきた。具体的に研究１では、造精機能障害を呈する代表的疾患である停留精巣を対象疾患とし、モデル動物とヒト検体を用いることでSSCの幹細胞活性と、それが精細胞分化に及ぼす影響を検討した。その結果、幼若な精細胞であるA型精原細胞が、自己複製能・多能性・未分化性の維持を保持した精子幹細胞であること、精子幹細胞活性の評価に、精子幹細胞関連遺伝子であるUTF1が有用な指標であることを明らかにした。また、精子幹細胞には活性型と潜在型の2タイプが存在し、その比率のバランスが初期精子形成に重要であることを突き止めた。さらに停留精巣では精子幹細胞の機能が低下していることを解明した。これらのことから、幹細胞活性の観点で造精機能障害を検証する有用性を示すことができたと考える。研究２では、造精機能障害精巣を用い、PCR-Subtraction法によりSSCにおいて発現変化する遺伝子群の抽出を行った。さらに一部でMicroarray解析も追加し、スクリーニングを徹底した。これらの遺伝子群について定量RT-PCRやWestern Blotting、免疫染色を行い発現量や局在を検討した結果、UTF1以外にEEF1A1,TPT1,FOXO1が精子形成に重要な遺伝子である可能性を見出した。

さらにKDM5Aといったヒストンタンパクの脱メチル化現象の変化も確認し、精子形成におけるエピジェネティックな制御機構の存在も見出した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究３．「精子幹細胞の培養系の確立と造精機能を制御する遺伝子群カスケードの解明」を進めた。まず、精子幹細胞の培養系の確立を目指した。これまでに私たちはラット精巣では生後9日前後に精子幹細胞が出現することを確認している。そこで本来であれば同日齢で幹細胞の分離培養を行いたいが、幹細胞の絶対数が少ないため困難であった。そこでまず成体期のラット精巣を用いて培養系の確立を目指した。具体的には、摘出精巣をホモジネートして細胞を分散させ、まずI型コラーゲンを使用して精子形成細胞を回収した。次にラミニンに精子幹細胞を接着させることで、高率に精巣幹細胞を分離回収することを考えた。c-kit、Oct4、Ngn3等幹細胞表面マーカーの発現解析で幹細胞の確認を行った。
以上のことから本研究はおおむね順調に経過していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

精巣幹細胞の安定した培養手技を確立できれば、幼若期精巣もしくは胎生期精巣で同様の培養を行う。続いて候補遺伝子の発現量の確認と機能解析を行う。具体的には正常精巣と造精機能障害精巣でそれぞれ幹細胞培養し、その2者間でPCR-SubtractionもしくはMicroarrayを行うことで精子幹細胞特異的な遺伝子発現変化のスクリーニングを行うとともにこれまでに得られた遺伝子群との一致性を検討する。これらについて、精子幹細胞の培養系を用いて、目的タンパク質発現ベクターを作成し、培養細胞へ遺伝子導入させ、強制発現およびsiRNAを用いたノックダウンを行い、精細胞分化を検討する。なお精巣への遺伝子導入は、精細胞系とセルトリ・ライディッヒ細胞に選択的に行えるアデノウィルスベクター法を用いたトランスフェクションを行う。ここまでで明らかとなった遺伝子についてモデルラット精巣およびヒト不妊症精巣においてin situ hybridizationや免疫染色を行い、臨床的な造精機能障害のマーカーとなるかを検討する。

Causes of Carryover

停留精巣モデルラットからの精原細胞の単離培養が困難であったため、培養系統樹立後に予定していた実験に変更が生じ、その結果として次年度使用額が発生した。
具体的にはラット精巣からの精原細胞が大変少ないうえに、セルトリ細胞などの体細胞がコンタミネーションするため単独遊離が困難であった。また精原細胞のラミニンコートへの付着の結果は悪くなかったが、viableな精原細胞を培養系樹立に必要な十分量を採取できる見込みが低いと判断した。

Expenditure Plan for Carryover Budget

既存の精原細胞株の購入および培養条件の確定に次年度使用額をあてることを考えている。また遺伝子導入およびノックダウンについても改めて条件設定から開始する必要があり、こちらにも次年度使用額をあてようと考えている。
これまで行ってきた培養系統樹立の手技と問題点を生かすことで、可能であれば既存の精原細胞株にある程度の脱分化を促すことで当初私たちが目標としていた精子幹細胞の機能解析に近づけたいと考えている。