精巣内体細胞におけるDAX1の機能解析とアデノウィルスベクターを用いた臨床応用

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25861439
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 黒川 覚史 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (50468253)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: DAX1 / アデノウイルス / 遺伝子導入 / 造精機能 / モデルラット

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、精巣内体細胞であるセルトリ細胞とライディッヒ細胞における、転写因子DAX1の機能を解明すること。その後DAX1遺伝子をマウス・ラットの精巣内に遺伝子導入し、造精機能への影響を検討することを目指している。そのために以下の4つを計画している。１. DAX1発現アデノウイルスベクターの作製、２. 培養細胞(セルトリ細胞とライディッヒ細胞)における” in vitro ”でのDAX1機能解析、３. ラット精巣に対するアデノウイルスベクター投与の条件検討、４. ラット精巣における” in vivo ”でのDAX1機能解析、である。現在までに１と２が終了し、３に取りかかっている。
１. DAX1発現アデノウイルスベクターの作製：サブクローニングによりプラスミド内で遺伝子配列を作製した。目的遺伝子を発現させるためのプロモーター、マウスDAX1遺伝子のcDNAとマーカータンパクeGFPのcDNAを非増殖型ヒト5型アデノウイルスゲノムDNAに組込んだ。その後は増殖に必要なE1領域を発現するHEK293細胞内では増殖させた。HEK293細胞内で増殖したアデノウイルスをカラムクロマトグラフィーで精製しタイター測定によりウイルス溶液を調製した。
２. 培養細胞における” in vitro ”でのDAX1機能解析：セルトリ細胞とライディッヒ細胞を用いた。アデノウイルスベクターを用いてDAX1遺伝子を遺伝子導入しgain-of-function解析を行った。
３.ラット精巣に対するアデノウイルスベクター投与の条件検討：アデノウイルスベクター投与後のDAX1発現の局在と経時的な変化を解析し、適切なウイルスタイターを検討中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

アデノウイルスベクターの調製とタイター調整に、手間と時間がかかるためである。
ベクターとして使用しているアデノウイルスは非増殖性であるが、増殖に必要なE1領域を発現するHEK293細胞内では増殖可能である。HEK293細胞内で増殖したアデノウイルスを培養細胞ごと回収し凍結融解により細胞壁を破壊したあと、Adeno-X Maxi Purification kit (Clonetech社) のカラムクロマトグラフィーで精製する。さらに、Adeno-X Rapid Titer kitを用いてタイター測定しウイルス溶液を調製している。大量の培養細胞を継代しているが、少量のウイルス溶液しか精製できないために研究に時間がかかっている。

Strategy for Future Research Activity

研究指導者・研究協力者との連携を密にして、研究の共有化をはかる。特に、指導的立場の研究者が全体を俯瞰して研究をコントロールし、ポイントとなる部分や省ける部分を選別する。

Causes of Carryover

予定では以下の4つを計画している。１. DAX1発現アデノウイルスベクターの作製、２. 培養細胞(セルトリ細胞とライディッヒ細胞)における” in vitro ”でのDAX1機能解析、３. ラット精巣に対するアデノウイルスベクター投与の条件検討、４. ラット精巣における” in vivo ”でのDAX1機能解析、である。現在は、１と２が終了し３に取りかかっている段階であるので、３の続きと４を次年度に行う予定である

Expenditure Plan for Carryover Budget

以下の３と４を予定している。
３.ラット精巣に対するアデノウイルスベクター投与の条件検討：アデノウイルスベクター投与後のDAX1発現の局在と経時的な変化を解析し、適切なウイルスタイターを検討中である。４.ラット精巣における” in vivo ”でのDAX1機能解析：適切なウイルスタイターでベクター投与後、造精機能や遺伝子発現の変化についての再現性を確認する。アデノウイルスベクターの投与法は精巣内投与と全身投与に分ける。