癌幹細胞抗原DNAJB8を標的としたペプチド免疫療法の確立

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25861446
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Research Institution: Wakayama Medical University
• Principal Investigator: 西澤 哲 和歌山県立医科大学, 医学部, 博士研究員 (90458076)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: DNAJB8 / 癌幹細胞 / 免疫療法 / ペプチド

Research Abstract

ペプチド結合アッセイ：Web上で4つの候補ペプチド（DNAJB8 (22-30) AYRKLALRW、DNAJB8 (90-99) GYTFRNPEDI、DNAJB8 (99-107) IFREFFGGL、DNAJB8 (143-151) AFMEAFSSF）を推定し、実際のHLA-A24に対する結合能についてはペプチド結合アッセイで確認した。
HLA-A24に結合する下記の３つの候補ペプチドを同定し、このペプチド免疫により、CTLが誘導可能かどうか後述の実験で検討した。
DNAJB8 (22-30) AYRKLALRW、DNAJB8 (99-107) IFREFFGGL、DNAJB8 (143-151) AFMEAFSSF
候補ペプチド刺激によるペプチド特異的CTL誘導の確認
IFN-γアッセイ：HLA-A24陽性健常者からCD8陽性細胞を採取し、候補ペプチドを提示する抗原提示細胞（PHA芽球）で３回刺激し、Effector細胞とした。Target細胞はペプチド刺激したT2A24細胞（TAP；transporter associated with antigen processingを欠損した細胞、内在性の抗原提示ができず、刺激したペプチドを効率的に提示できる）を用いた。Target細胞のcontrolとして用いたK562（MHC classIが低発現のため、CTLの標的になりにくい）に対しては、Effector細胞によるIFN-γの産生を認めず、候補ペプチドで刺激したT2A24細胞に対しては、それぞれIFN-γ産生が確認され、ペプチド刺激によるCTLの誘導が示された。
LDH releaseアッセイ：誘導したCTLの細胞傷害活性についてはLDH releaseアッセイで評価した。DNAJB8 (22-30)、DNAJB8 (99-107)で刺激したT2A24細胞に対して、誘導したCTLによる細胞傷害活性を認めた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

抗原ペプチドの同定とそのペプチド刺激により細胞傷害活性を認めるペプチド特異的なCTLの誘導が可能であることが示されたため。

Strategy for Future Research Activity

マウスを用いた実験系でin vivoでのCTL誘導を評価する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

当初計画より必要な物品、旅費、人件費に差異が生じたため。
PBMCからCD8陽性細胞を分離するためにMACSカラム、抗CD8 MACS抗体を購入する。腫瘍細胞、CTL、SP細胞の培養のための器具、試薬（fetal bovine serum、medium、恒常発現株を選択するための薬剤等）が必要である。DCを誘導するためにGM-CSF、IL-4を必要とする。PHA blastの誘導、CTL誘導を行うためIL-2、PHAが必要である。細胞内IFNγをFACSで解析するために各種抗体、薬剤が必要である。細胞傷害活性を検討するために細胞傷害性検出キット（Roche）を購入する。抗原ペプチドの免疫実験を行うためにBALB/cマウスとNOD/SCIDマウスを購入する。