卵母細胞特異的に発現するTAp63α-Bnc1シグナルの機能解析

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25861462
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 坂本 雅弘 東北大学, 大学病院, 技能補佐員 (50645299)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: TAp63α / 卵母細胞

Outline of Annual Research Achievements

卵母細胞の成熟過程における卵胞発育障害は早発閉経や高齢不妊患者において治療困難な病因であり、病因の大半が原因不明である。本研究はp53ファミリーに属するp63 isoformであるTAp63αの卵母細胞における生理的意義について、生殖細胞特異的に高発現するBasonuclin1(Bnc1)の直接的な遺伝子発現制御メカニズムに焦点を当てて、分子レベル・遺伝子レベルで解析し、早発閉経や加齢におけるTAp63αの役割について明らかにすることを目的としている。今年度に得られた知見は以下の通りである。
Bnc1遺伝子が極微量に発現しているHEK293細胞にTAp63αを過剰発現させた場合、細胞増殖が抑制され、Bnc1遺伝子の発現が減少した。これまでにルシフェラーゼアッセイの実験系でp63はBnc1プロモーター領域に結合し、Bnc1遺伝子発現を促進することが報告されているが、逆の結果となった。
去年までに日齢４日目の仔マウスから卵母細胞を回収する方法・技術は確立したが、長期培養でTAp63αの過剰発現下において卵母細胞を培養することができなかった。
日齢４日目の卵母細胞を収集して顆粒膜細胞を除去して培養すると、そのほとんどが早期に死滅した。
Tap63αは共焦点レーザー顕微鏡を用いた免疫蛍光染色法で一次卵胞から初期の胞状卵胞まで発現するが、成熟卵母細胞においてはTAp63αの発現を認めない。生殖細胞特異的に高発現するBnc１遺伝子は293細胞にも極少量発現するようであるが、ウェスタンブロットでは蛋白レベルで確認できない。そのため、質量分析器を用いてBnc1に結合する蛋白質候補を検出し、TAp63αが関与しそうなシグナル伝達経路の蛋白質を探索した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

申請書通りのペースで研究が進んでいるわけではないが、概ね計画書通りに進んでいる。
震災のため故障したマニュピレーターの替わりにマイクロインジェクションをできる施設を借りて、卵母細胞にmRNAをマイクロインジェクションできる環境を確立できた。
子宮頸部腺細胞HeLa細胞と同様に、HEK293細胞においてTAp63αがBnc1の遺伝子発現を正に制御するわけではないことを示すことができたのは、これまでの報告とは逆の結果であり、TAp63αの役割について真実を明らかにすることができる可能性が高まった。マウス卵巣から一次卵胞などの未熟卵母細胞を収集する技術を確立し、リアルタイムPCRで遺伝子発現レベルを検討することができた。
また、質量分析器を用いたMS解析の結果は、TAp63α- Bnc1シグナルの機能を解明する上で強力なツールとなった。TAp63αが関与するシグナル伝達経路の下流について解析することができたことは研究計画書にはない解析ではあるが、本来の目的を達成することができた。

Strategy for Future Research Activity

これまでの計画書通りに進めていく。
その他の追加実験として、質量分析器を用いたMS解析が順調に進んでいるので、TAp63α-Bnc1シグナルの下流を明らかにしていくと共に、TAp63αがBnc1遺伝子発現を細胞特異的に（卵母細胞特異的に）制御するシステムを、１次卵胞期の卵母細胞と成熟したGV期の卵母細胞を用いて、TAp63αが結合するBnc1のプロモーター領域のメチル化について比較検討する。同時に加齢卵ともBnc1プロモーター領域のメチル化を比較検討する。

Causes of Carryover

次年度使用額は今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成27年度請求額と合わせ、平成27年度の研究遂行に使用する予定である。