直腸肛門奇形モデルマウスを使用した肛門形成シグナルの探究

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25861665
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 中田 光政 千葉大学, 医学部附属病院, 助教 (90375775)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 直腸肛門奇形 / Wnt5aコンディショナルノックアウトマウス / 肛門括約筋

Outline of Annual Research Achievements

直腸肛門奇形では手術により，肛門を形成して排便ルートを確保するが，肛門括約筋の発達が未熟で術後の排便機能が改善しない症例も多くある．直腸肛門奇形は，遺伝性はないものの約半数に合併奇形が存在し，発生過程における遺伝子発現レベルの低下が疾患発症，および肛門括約筋群の未熟性の要因となっていることが考えられる．基礎医学的には原因遺伝子は同定されていなく，肛門の開口・肛門括約筋群の発達に関与する遺伝子も未だ十分解明されていない．直腸肛門奇形モデルマウスを使用し，肛門の開口・肛門括約筋群の発達に関与する遺伝子を同定することで肛門括約筋発達の分化促進の可能性を検討する．研究計画はモデルマウスによる発生学的解剖の観察と遺伝子発現解析，および分化誘導実験である．これまでSdマウス，レチノイン酸投与マウスの2種類のモデルマウスを使用し，直腸肛門奇形の発生学的にcloacal plateの伸長が不全になり，遺伝子発現解析ではWnt5aが関与することを同定した．新たにWnt5aコンディショナルノックアウトマウスを使用した．Wnt5a-loxpマウスとCRE-ERTマウスにおいてWnt5a loxp/loxp,CRE+/-雄×Wnt5a loxp/loxp雌の交配で得られる胎仔に対してタモキシフェンを腹腔内投与し，CREを発動させてWnt5aをノックアウトさせ，表現形を得る．まず，直腸肛門領域における至適投与量至適時期を検討する必要がある．至適投与時期にタモキシフェンを投与し，経時的に直腸肛門発生をHE染色で観察する．また，発生過程で発現する遺伝子をスクリーニングする．マイクロアレイや，既知の発現遺伝子解析で行う．また，発現部位を免疫染色で解析する．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

初年度はマウスを一組のつがいから繁殖し，Wnt5a loxp/loxp,CRE+/-雄×Wnt5a loxp/loxp雌の交配ができるところまで数を増やした．数の少ないところからの繁殖であったため，充分な数まで増殖するのに時間を要した．併行して野生型でタモキシフェンの毒性についての検討を施行した．
本年度，モデルマウスでのタモキシフェンの誘導性を検討した．タモキシフェンを0.05，0.1mg/g（母体）と振り分け，行った．E8.0，9.0，10.0，12.0，14.0においてそれぞれ腹腔内投与し，毒性と表現型を調べた．E10.0，E12.0，E14.0ではタモキシフェンの濃度に依存することなく，表現型はWTと同様であった．E8.0，E9.0ではタモキシフェン0.1mg/gでは致死性であったが，0.05mg/gで生存し，は直腸肛門奇形の表現型を示した．

Strategy for Future Research Activity

Wnt5a コンディショナルノックアウトマウスで投与するタモキシフェンを0.05mg/g（母体）とし，E9.0における投与で検討する．E10.0，E12.0，E14.0における直腸肛門発生や肛門括約筋組織発生の変化をHE染色で観察する． Wnt5a コンディショナルノックアウトマウスの直腸肛門の mRNA を回収し，マイクロアレイにて遺伝子発現解析を行い，Wnt5a発現低下により低下する遺伝子を振り分ける予定である．

Causes of Carryover

実験はやや遅れて進行中で3年間の期限では終了できず，延長申請するに至りました．
当該年度は更にその前年度からの繰越があったため，当該年度分を消費するに至りませんでした．
次年度使用額は当該年度の繰り越し分であり，当該年度に使用可能な支払い請求額をそのまま次年度に繰り越しました．

Expenditure Plan for Carryover Budget

今後の実験計画では，Wnt5a コンディショナルノックアウトマウスで投与するタモキシフェンを0.05mg/g（母体）とし，E9.0における投与で検討します．E10.0，E12.0，E14.0における直腸肛門発生や肛門括約筋組織発生の変化をHE染色で観察します． Wnt5a コンディショナルノックアウトマウスの直腸肛門の mRNA を回収し，マイクロアレイにて遺伝子発現解析を行い，Wnt5a発現低下により低下する遺伝子を振り分ける予定です．したがって，マウスの維持と薬品購入に充てる予定です．