低酸素応答システムによる代謝制御を用いた多臓器不全に対する臓器保護戦略

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25861725
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 柳 大介 横浜市立大学, 附属市民総合医療センター, 助教 (80638586)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 臓器障害 / 低酸素誘導性因子 / 細胞代謝

Research Abstract

まず，肺上皮細胞培養系としてMLE15を用いてTNF-α刺激に対するサイトカイン分泌がHIF-1によってどのように制御されているのかを検討した．siRNAを用いてHIF-1αをノックダウンすると，CXCL-1の著明な分泌増加が見られ，HIF-1が肺上皮細胞において抗炎症効果を持つ可能性が示唆された．一方で，MLE15及び，肝細胞培養系としてHepa 1-6を用いてLPS刺激を行ったが，HIF-1やATPの有意な変化は見られなかった．
これを踏まえ敗血症の病態におけるHIF-1，ATPの変化について個体レベルでの評価を行うためにLPS腹腔内投与によるマウス敗血症モデルを作成し，予備的な検討を行った．LPS10mg/kg腹腔内投与にて，肺胞洗浄液中のタンパク濃度，CXCL-1濃度，MPO濃度が増加することをまず確かめた．さらにHIF-1の変化についてELISAを行った所，肺においてはLPS投与6時間後にHIF-1 alphaの増加傾向が見られた．肝臓においては明らかではなかった．ATP濃度の変化についてはAMERICのATP抽出キットを用いて測定条件の検討を行った．肝臓ではPBSでのホモジナイズ後においてもATP濃度の測定が可能であったが，肺においては測定限界以下であった．そこでPBSを用いずに，組織を直接TE飽和フェノールにて溶解した所，検出することが可能となった．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

In vitroにおける臓器障害モデルにおいては明らかなHIF-1，ATPの変化が見られなかったため，動物モデルでの検討を先行させることとしたため，研究計画に変更が生じた．
昨年度の予備実験により，測定系の構築ができ今後の実験がスムーズにすすめられるものと考えられる．

Strategy for Future Research Activity

臓器障害については，肺傷害がいままでの研究における経験もあり，検討がしやすいと考えた．そのため，モデルとしてはLPS腹腔内投与モデルとLPS気管内投与モデルを中心に実験を進める．
昨年度の実験をもとにして，HIF-1とATPのこれらのモデルでの挙動について検討を行う．
次にHIF-1 alphaのオーバエクスプレッションによる臓器保護効果の検討を行う．方法としてはPHD阻害剤であるDMOGを用いる方法と，HIF-1のconstitutive active formをウイルスベクターとして導入する方法の両面から実験を進める．
これらの結果を踏まえて，臓器障害における表現形をin vitroでどのように検討するか決定していく．