2013 Fiscal Year Research-status Report
DKK-3をターゲットとした頭頸部扁平上皮癌の転移抑制
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25861742
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Kawasaki Medical School |
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Principal Investigator |
片瀬 直樹 川崎医科大学, 医学部, 助教 (30566071)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 頭頸部扁平上皮癌 / DKK3 / 遺伝子機能解析 / 強制発現 / western blotting / Real time PCR / ELISA / Transfection |
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| Research Abstract |
本研究では、頭頸部扁平上皮癌におけるDKK3遺伝子の詳細な機能解析と腫瘍転移制御に向けた基礎研究の構築を目的としている。平成２５年度は(1)頭頸部癌とそれ以外の臓器の癌でのDKK3発現の有無の確認、(2)DKK3低発現株に対する強制発現系の検討、(3)DKK3強制発現による細胞への影響について検討を行った。
(1)では各種の癌におけるDKK3の発現を比較するため、頭頸部癌８種、食道癌3種、胃癌４種、大腸癌5種、膵臓癌3種、前立腺癌3種を使用した。DKK3タンパクおよびmRNAは、頭頸部と食道の扁平上皮癌の全ての株と、膵臓癌由来細胞の一部に発現していたが、その他の癌では発現が認められなかった。(2)ではDKK3低発現の頭頸部癌細胞株に対して、DKK3 expression plasmidを導入した強制発現系を構築し、mRNAとタンパクの発現変化を評価した。導入によりDKK3 mRNA発現は有意に増加したが、タンパク発現は増加しなかった。DKK3は分泌型タンパクであるので、過剰産生されたタンパクが培養上清中に放出されている可能性を考え、培養上清中のDKK3のELISAを試みたが、上清中のDKK3濃度にも変化がなかった。(3)では、頭頸部癌細胞にDKK3を導入後、アポトーシスアッセイを行ったが、頭頸部癌細胞株ではアポトーシスを誘導しなかった。これは、これまでに多数報告されている「DKK3発現がない癌細胞に強制発現させると細胞死を誘導する」という現象とは異なる結果であった。
以上の結果から、DKK3発現および発現時の反応は頭頸部・食道扁平上皮癌に特異的なパターンを示す可能性が考えられた。RNA発現とタンパク発現が一致しない細胞の存在や、mRNAを強制発現させてもタンパク発現が増加しないことからは、頭頸部癌細胞にはDKK3の発現調節機構が存在していると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２５年度はDKK3高発現株と低発現株の同定と強制発現およびshRNAによるノックダウン株の作製を実施した。以下、(1)DKK3ノックダウン株の作製、(2)低発現株への強制発現系、(3)DKK3ノックダウン／強制発現によるシグナルへの影響について具体的な実施項目を列記し、それぞれの進行状況についての自己点検評価を記載する。
(1)では、DKK3高発現株の選別は予定通り進行している。ノックダウン株の作製については、siRNAによるtransientなノックダウンには成功しており、機能解析の基礎実験に使用した。また、最終的な目的である動物への移植実験への使用を可能にするため、shRNAのトランスフェクションによるstable knockdown株の作製も行ったが、導入効率に問題があったため、Lentivirusによる導入系に切り替えることとした。(2)については、上述のごとく強制発現系の構築は予定通り進行している。現在はAdenovirusを用いた強制発現系の構築が進行中である。必要になる組替えDNA実験については、川崎医科大学 組換えDNA実験安全委員会に計画書を提出し、承認されている。(3)については、これまでの研究でDKK3ノックダウンにより、細胞の浸潤性、遊走性が低下することを報告しているが、そのメカニズムはWNTシグナルと無関係である可能性が示唆されている。そこでLentivirus、Adenovirusによるノックダウン系、強制発現系を確立し、その影響をmicroarrayで検討する予定である。また、DKK3と反応するレセプターやシグナルについても不明な点が多いが、HA-Tag付きのDKK3 expression plasmidを作製して、DKK3と直接的に結合するタンパクを検出する実験系を構築中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２６年以降では、in vivo実験系の確立とDKK3 mutation解析が予定されているが、平成２５年度の成果をもとに実験を追加する。また、in vivo実験に関しては申請者の異動に伴い、一部が実施困難になっているため計画を修正する。
追加実験（1）：平成２５年度分を発展させた実験を追加して、lipofectionによる系と Adenovirusによる系の、2種類の強制発現系の確立を進める。これにより、in vivo実験系に使用可能な強制発現株の樹立が同時に達成される。強制発現によるWNTシグナルその他への影響については、microarray解析で関連分子を絞り込む。また、HA-Tag付きのDKK3 expression plasmidのtransfectionを行い、免疫沈降とwestern blottingでDKK3と直接結合する因子を同定する。
追加実験（2）：Lentivirusを使用したshRNA plasmidの導入により、stableにDKK3発現が低下した株を作製する。既に確立済みのsiRNAによるtransientなノックダウン系とも合わせて、シグナルヘの影響をmicroarrayで分析する。transient, stableのノックダウンの比較、および上記の強制発現系の結果とも合わせて、DKK3と関連するシグナルを絞り込む。
計画修正：in vivo実験系およびmutation解析については、申請者が研究機関を異動したため、蛍光イメージングを使用した実験と実際の症例を使用したmutation解析が困難である。in vivo実験については、通常の組織学的解析を優先的に進める。mutation解析についても細胞株での解析を先に進め、倫理委員会の承認を得た後、臨床科と連携して臨床材料を使用した研究を実施する体制を整える。
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Research Products
(19 results)
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[Journal Article] Expression and roles of CCN2 in dental mesenchymal cells in primary culture-With findings in a case of odontogenic myxofibroma.2014
Author(s)
Shimo T, Koyama E, Horikiri Y, Okui T, Kurio N, Katase N, Yoshida S, Takebe Y, Kishimoto K, Yoshioka N, Nagatsuka H, Sasaki A
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Journal Title
Oral Sci Int.
Volume: 11巻1号
Pages: 8-14
DOI
Peer Reviewed
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