2013 Fiscal Year Research-status Report
EphA4の未知なるリガンドの解明と臨床応用への可能性の追及
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25861843
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
伊志嶺 知沙 (黒田 知沙) 岡山大学, 大学病院, 助教 (40581096)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | シグナル伝達 / 骨代謝 |
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| Research Abstract |
Eph分子は受容体型チロシンキナーゼであり、EphA群、EphB群に大きく分けられ、現在ヒトではEphA1～EphA8、EphB1～EphB4および6という名称で整理されている。EphA4は比較的最近になって注目されはじめた分子であり、神経領域での研究は進んでいるが、骨、軟骨における分布状況や機能は未だ不明である。以前の研究では、軟骨細胞様細胞株(HCS-2/8)において強く発現していたEphA4の長管骨組織における発現、分布と機能を調べた。しかし、まだまだ不明な点が多いため、以前の研究を踏まえつつ、違った視点からも研究を進めていくこととした。
EphA4はチロシンキナーゼ型細胞表面受容体分子であり、その特異的リガンドとしてはephrinB2やephrinA2などが知られている。申請者らの以前の研究で、軟骨肉腫由来細胞株HCS-2/8細胞に発現しているチロシンキナーゼ型受容体を探索した折に、EphA4がその一つとして同定され、リガンドとして考えられているephrinA2 は内軟骨性骨化においてEphA4より前の段階で発現のピークがあった。EphA4のリガンドは現在不明な点が多いとされている。そこで今回の実験ではまずリガンドに着目し、リガンドを網羅的に調査することによってEphA4の新規のタンパク質間相互作用が明らかとなり、シグナル伝達経路・疾患関連経路のマッピングなどの解析が可能となる。また申請者らの研究室の実験で、義歯を装着したラットの骨吸収に関する実験、歯牙喪失と空間認知能に関する実験が行われており、FilosaらによるとEphA4とephrin-A3の相互作用によるシグナリングは、アストロサイトによるシナプス機能と可塑性を制御するのに重要であると報告された。よって、歯牙喪失における海馬でのEphA4の発現、機能を探索するものである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
現在までに①プロテインアレイによる網羅的なタンパク質相互作用解析を行い、②組織標本の作製を行い二種類の抗体を使用し免疫染色の結果を出している。更に検討を行うために何種類かの抗体で染色予定である。またこの結果を元にRNA、タンパクを調べリガンドの移行経路、働きなどを調査予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度までにRNA抽出とリアルタイム-PCRを免疫染色でEphA4を確認できた組織からRNAをRNA抽出試薬にて抽出する。LightCyclerシステムでTOYOBO SYBR GREEN PCR Master Mixを使用する予定である。またウエスタンブロットを4-20%勾配ポリアクリルアミドゲルを使用し脳組織から回収したタンパクを電気泳動した。膜に抗EphA4抗体を反応させ、さらにHRPコンジュレート抗ラビットIgGを反応させる。タンパクはECL Western Blotting Detectionシステムを使用し検出する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
RNA抽出とタンパク定量のため、各当部の免疫染色を行ったが、時間を要したため次年度に繰り越すこととなった。
次年度はRNA抽出とリアルタイム-PCRを免疫染色でEphA4を確認できた組織からRNAをRNA抽出試薬にて抽出する。LightCyclerシステムでTOYOBO SYBR GREEN PCR Master Mixを使用する予定である。またウエスタンブロットを4-20%勾配ポリアクリルアミドゲルを使用し脳組織から回収したタンパクを電気泳動した。膜に抗EphA4抗体を反応させ、さらにHRPコンジュレート抗ラビットIgGを反応させる。タンパクはECL Western Blotting Detectionシステムを使用し検出する。
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