無血清胚様体培養系を用いた顎顔面遺伝性疾患由来ヒトiPS細胞の分化能解析

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25861945
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 鍋島 巧 広島大学, 大学病院, 歯科診療医 (10550999)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: iPS細胞 / 再生医療

Outline of Annual Research Achievements

再集合培養法を応用したヒトiPS 細胞からの軟骨組織誘導について，誘導方法の条件検討を前年度に引き続き行った。
まず，健常人由来iPS 細胞を2 群に分けて，浮遊培養用プレートに播種した。一方の群にはアクチビンA を添加し(アクチビンA 処理群)，48 時間培養を行い胚様体を形成させた。もう一方の群にはアクチビンA を添加せず(アクチビンA 未処理群)，同様に48 時間培養を行い，胚様体を形成させた。続いて，アクチビンA 処理群とアクチビンA 未処理群の胚様体を1 つのwell に混合して培養し，両群の胚様体が一塊となった集合胚葉体を形成させた。この集合胚葉体を最長3ヶ月間間培養を行った。胚様態の混合比率は，アクチビン処理群A処理群:アクチビンA未処理群を，1:1のほか1:3や1:5など様々な比率とした。
培養された集合体から，組織切片を作成し組織学的に検討を行った。さらに，PAS染色，typeⅡコラーゲンによる免疫組織化学染色によっても検討を行った。
その結果，1:1の集合体にて，明らかな軟骨組織の組織形態は認めなかったものの，PAS染色やtypeⅡコラーゲンでは一部要請を認めた。また，集合胚葉体からRNA を抽出し，顎顔面領域に関わる，頭部・顎軟骨・眼・咽頭や神経堤のマーカー遺伝子群であるCol2，Sox9，gsc，Otx2，AP2 並びにPax6 発現の有無を検討したところ，Otx2，AP2の発現を認めた。