発達期脳神経における全身麻酔薬による細胞死誘導の機序解明

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25861974
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Research Institution: Showa University
• Principal Investigator: 西村 晶子 昭和大学, 歯学部, 助教 (00551227)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: アポトーシス / 全身麻酔薬 / 脳神経細胞死 / SCAT3

Research Abstract

胎児期ー小児期の全身麻酔薬投与が成長発育に与える影響について検証するため、本研究では全身麻酔薬投与による脳神経細胞のアポトーシス誘導についてSCAT3遺伝子プローブを利用した検証を計画した。
SCAT3遺伝子プローブはアポトーシス変化に至るカスパーゼ3活性により蛍光強度が変化する蛍光タンパクを細胞内に発現する。この遺伝子プローブを検証するためHeLa細胞に遺伝子導入し、TNFα／CHXによるカスパーゼ3活性を蛍光顕微鏡下で観察した。TNFα／CHX投与後1-2時間程度で蛍光強度の変化が観察された。濃度依存性は顕著ではなく、投与後2-3時間までに変化する細胞が多数であった。
脳神経細胞における全身麻酔薬投与による影響を検討するため、SCAT3遺伝子を導入した遺伝子改変マウスの継代維持を行った。理化学研究所より凍結精子を購入し、当研究機関の遺伝子組換え実験室に胚操作を依頼した。SCAT3遺伝子を発現した新生仔マウスは表皮全体でGFP励起の蛍光を確認できるため、ヘテロ接合体で継代維持しつつ、ホモ接合体を作製した。ホモ接合体の個体はヘテロ接合体の個体と比較し、表現系に明らかな違いは認められず繁殖を継続することが可能であった。
SCAT3遺伝子プローブを発現した新生仔マウスから初代培養神経細胞を製作し、ウェスタンブロッティング解析に用いた。また脳のスライス標本を作製し、蛍光顕微鏡下で観察した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成25年度に計画された(1)HeLa細胞を用いたSCAT3遺伝子プローブの検証および(2)SCAT3遺伝子改変マウスの胚操作と継代維持は年度内に終了した。現在は平成26年度以降に計画された(3)マウス大脳皮質初代培養神経細胞の製作と(4)蛍光顕微鏡観察とウェスタンブロッティング解析を進めており、おおむね順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

新生仔マウスの全身麻酔薬投与後のウェスタンブロッティング解析および組織学的検証により、脳神経細胞にカスパーゼ活性もしくはアポトーシス変化をもたらす薬剤量や投与時間・投与期間などについて検討する。これらの結果を参考に、蛍光顕微鏡下で大脳皮質および海馬を観察し全身麻酔薬の影響を検証する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

本年度に計画していた学会発表を行わなかったため、費用が発生しなかったため。
次年度は研究成果の学会発表を計画しているため、そこで使用する予定である。