2013 Fiscal Year Research-status Report
多色発光ベクターによるヒト歯根膜活性化薬物のハイスループット選別法の開発
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25862060
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | The Nippon Dental University |
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Principal Investigator |
鳥居 大祐 日本歯科大学, 生命歯学部, 助教 (10548259)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 歯根膜 / 間葉系幹細胞 / セメント芽細胞 / セメント質 / BMP-7 / レポーターアッセイ / 化合物ライブラリー / 化合物スクリーニング |
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| Research Abstract |
歯根膜の間葉系細胞集団には、骨芽細胞あるいはセメント芽細胞への分化能を持つ前駆細胞の存在が知られている。
本研究では、セメント芽細胞への特異的分化機構の詳細を明らかにするとともに、セメント芽細胞分化促進作用を持つ化合物のハイスループット・スクリーニング法の開発を目的としている。
本年度は、正常および不死化ヒト培養歯根膜細胞について多能性幹細胞マーカーSSEA-3（stage-specific embryonic antigen-3）を発現するごく少数の細胞をFACSで分取し、維持培養用培地中で培養後、その培養系での石灰化能を化学染色法とEPMA（電子線マイクロアナリシス法）で確認した。
また、BMP-7（bone morphogenetic protein 7）のヒト組換え体タンパク質添加によるセメント芽細胞分化を免疫組織化学的に検証し、セメント芽細胞特異的マーカーであるCAP（cementum attachment protein）とCEMP1（cementum protein 1）に対する抗体を用いた免疫染色の結果から、FACSで純化した正常および不死化ヒト培養歯根膜細胞はほぼすべてセメント芽細胞になりうる間葉系幹細胞の集団であることを確認した。
CAP遺伝子とCEMP1遺伝子の各プロモーター領域をそれぞれ、レポーターベクターとしてpSLR（stable luciferase red）test vector（赤色発光、最大波長630nm）とpSLO（orange）test vector（橙色発光、最大波長580nm）に挿入し、これらを同時に不死化ヒト培養歯根膜細胞へ導入し、組換えヒトBMP-7添加後の各レポーター活性変動を色分離機構搭載マルチウェルプレート対応ルミノメータによる発光測定で確認した。その結果、各ベクターのレポーター活性はBMP-7刺激で上昇し、一方、各プロモーター領域の部分欠損レポーターベクターを導入した場合にはBMP-7依存の活性上昇が抑制された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画はほぼ予定に沿った内容通り大きな問題や変更などの無い状態で遂行できている。
ヒト培養歯根膜細胞についてBMP-7刺激を行った際のRNA試料は確保しており、その一部は予定通りマイクロアレイ解析と定量RT-PCRに供した。追加の遺伝子発現解析実験に必要な試料・試薬も随時入手可能な状況である。
また、本年度の学会発表には未掲載であるが、幹細胞マーカー発現細胞の多分化能確認についても計画通り遂行した。
実験動物への細胞移植によるセメント質様組織形成能の検証に関しては未実施である。
多色発光ベクターによるレポーター活性の確認については当初の予定よりも早く実施できている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度に構築した発光検出系によるセメント芽細胞分化促進因子選別法を用いて、現在、利用可能な化合物ライブラリーのスクリーニングを進めている。
また、化合物スクリーニングの結果から細胞分化促進作用を示す候補化合物が得られた場合、遺伝子発現解析のほか、BMP-7刺激あるいは候補化合物添加によるセメント芽細胞分化誘導を行った細胞の実験動物への移植実験を実施し、そのセメント質様組織形成をin vivoにおける形態形成と比較して確認する予定である。
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