2015 Fiscal Year Research-status Report
歯周病由来SAAによる動脈硬化発症機序の分子生物学的アプローチ
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25862065
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| Research Institution | Aichi Gakuin University |
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Principal Investigator |
西田 英作 愛知学院大学, 歯学部, 助教 (10512519)
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2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 歯周病 / 動脈硬化症 / 血管内皮細胞 / 単球遊走因子 / 単球接着因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者は前研究機関にて動脈硬化易形成マウスであるApoEノックアウトマウスの腹腔内に、歯周病罹患時に上昇する炎症性サイトカインであるIL-6を投与し、擬似的な歯周病を惹起させる研究を行った。その結果、ApoEノックアウトマウスの肝臓組織のmRNA、および末梢血タンパクにおいて急性炎症マーカーである血清アミロイドA（以下SAA）が上昇し、動脈硬化症が増大することを見出した（未発表）。さらにin vitroにおいて、このSAAのリコンビナントタンパクでヒト大動脈血管内皮細胞（以下HAEC）を刺激したところ、単球接着分子のmRNAの発現が上昇することを確認した。現在まで、内皮細胞における動脈硬化症発生機序は多種多様な経路が報告されているため、本研究は歯周病由来による肝臓より産生されたSAAがどのような経路で血管内皮細胞の単球接着分子に作用しているかにフォーカスを当てる、つまり歯周病と動脈硬化発症機序をつなぐキー分子としてSAAに着目し、HAECを用いて分子生物学的に解明することを目的とした。
平成26年度まではHAECの培養条件とSAA刺激の条件を検討し、HAECにおいてSAAはTLR2を介しSELEの発現を上昇させることをPCR arrayとqPCR解析によって明らかにした。平成27年度はSAAがTLR2以下のどの経路でSELEの発現を増強するのかをqPCR、siRNA against TLR2にて確認した。その結果、SAA刺激はTLR2を介してMYD88非依存経路でSELEの発現を増強している可能性が示唆された。以上より、歯周病由来SAAはTLR2を介しMYD88非依存経路でHAECの接着分子の発現上昇を促して可能性がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
HAECの培養条件とSAA刺激の条件を検討した結果、6穴プレートに播種し、ヒトリコンビナントSAA は15ug/mlの濃度で刺激することとした。total RNA を抽出後、cDNAに変換し、PCR arrayとqPCR解析を行った。PCR array解析ではHAECはSAA刺激6時間にてSELEの発現が顕著に上昇することが明らかになった。qPCR解析でSAA receptorのスクリーニングを行ったところ、SAA刺激6時間にてTLR2の発現が劇的に上昇した。この結果をふまえ、SAAがTLR2以下のどのような経路でSELEの発現を制御しているのかをqPCR、TLR2におけるsiRNAにて確認した。siRNAはトランジェントトランスフェクションにて導入し、TLR2ノックダウン効率はウエスタンブロッティング法とqPCR法にて確認した。SAA刺激後6時間のHAECでは、TLR2、NFKB1、TNF、SELEの発現は顕著に上昇していた。MYD88の発現は、著変がなかった。TLR2をノックダウンしたSAA刺激後6時間のHAECは、TLR2、NFKB1、TNF、SELEの発現は減少していた。MYD88の発現に著変はなかった。以上の結果より、HAECにおいて、SAA刺激で最も発現の上昇したTLR2は、そのシグナル伝達系が活性化されると、炎症性サイトカインの発現を増強することが知られているが、本研究では、TLR2 signaling下流のNFKB1、TNFの炎症性因子の発現が上昇していることが分かった。また、SAA刺激はTLR2を介してMYD88の発現を変化させず、つまりMYD88非依存経路でSELEの発現を上昇させ、HAEC細胞外表面にて単球を集積させている可能性が示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成25年度から平成27度で行う予定で申請していた当課題は、ほぼ計画通り達成している。平成27年度に研究成果を日本歯科保存学会にて発表したが、論文としてまとめ、海外雑誌に投稿するまでには至っていない。平成28年度に補助事業期間延長を申請し、承認を得た。よって、平成28年度に残額分を論文校正料、投稿料、追加実験費として充てることにしたい。
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| Causes of Carryover |
平成27年度まで行う予定で申請していた当課題は前述したようにおおむね順調に進展している。平成27年度末までに数誌の海外雑誌に投稿を試みたが、リジェクトの判断がくだされ、内容の再考等が必要になった。申請時に提出した研究計画書には5万円と見積もりをしていた英文校正料と論文掲載料は、英文校正は1回に限るものではなく、また掲載料に関してはカラーページには見積もり以上の料金が発生すると見込んでいたが、論文がアクセプトに至らなかった為、平成27年度は約20万円の未使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年度に補助事業期間延長を申請し、承認を得た。よって、平成28年度は海外雑誌に投稿、アクセプトをめざし、残額分を論文校正料、投稿料、追加実験費として充てることにしたい。
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