2014 Fiscal Year Research-status Report
リボソームGTPaseセンター構成タンパク質の機能的分子機構の解明
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25870287
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
野村 隆臣 信州大学, 学術研究院繊維学系, 助教 (90362110)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | リボソーム / GTPaseセンター / ストーク / L7/L12 / P1-P2 / GTPase翻訳因子 / 生物界特異性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
リボソームとGTPase翻訳因子の相互作用には生物界特異性が見られ、リボソームのストークタンパク質が直接関与する。真正細菌ではL7/L12ホモダイマー（L7はL12のN末端アセチル化体であるため以後L12とする）、真核生物ではP1-P2ヘテロダイマー（P1とP2はアミノ酸配列が類似した異なる遺伝子産物）がストークタンパク質であり、① N末端ドメイン（NTD）がダイマー形成とL10（真正細菌）あるいはP0（真核生物）を介したリボソーム会合に関与、② C末端ドメイン（CTD）がGTPase翻訳因子との相互作用に関与、③ NTDとCTDが構造的柔軟性に富むヒンジ領域で連結、といった共通の特徴がある。一方、L12とP1-P2のアミノ酸配列相同性は低く、これに起因する構造的差異によって同一生物界のGTPase翻訳因子だけを識別すると考えられるが、正確に理解できていない。そこで、大腸菌L12のCTD、あるいはヒンジ領域からCTDをカイコP1またはP2のものに置換した4種のドメイン置換キメラ体（L12NC-P1C、L12N-P1HC、L12NC-P2C、L12N-P2HC）を作製し、ストークタンパク質によるGTPase翻訳因子の識別機構の解明に取り組んだ。
アライメント解析からカイコP1とP2のヒンジ領域とCTDを推定した後、4種のキメラ体の発現系を構築、大腸菌内発現、数段階のクロマトグラフィーによる精製を行った。得られた全てのキメラ体が大腸菌L10との複合体形成能を示し、リボソーム会合にはヒンジ領域とCTDは関与しないことを明確にした。また、各キメラ複合体を大腸菌リボソームにin vitro再構成したハイブリッドリボソームは、大腸菌ではなくカイコのGTPase翻訳伸長因子とのみ受容性を示し、この相互作用の大半はストークのCTDだけで生じ、P1とP2による差は小さいことが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画当初は、平成26年度にGTPaseセンター構成タンパク質の一つL11に注目して解析を進める予定であったが、平成27年度に計画していたストークタンパク質の解析が予想以上に順調に進んだため、平成26年度に繰り上げて解析を進めた。
結果、真核生物ストークタンパク質P1あるいはP2による真核生物由来GTPase翻訳伸長因子の特異的受容性はPタンパク質に見られる共通配列を含むC末端ドメインだけで十分であることを明らかにすることができた。また、P1とP2による差は小さいものの、P1のCTD配列を含むキメラストークタンパク質を導入した大腸菌ハイブリッドリボソームの方が常に活性が高くなることも明らかにすることができた。この理由については、まだ正確に理解できていないが、真核生物のストークタンパク質が真正細菌のものとは異なりヘテロである理由を解く鍵になることが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
交付申請書に記載した研究計画のうち、当初平成26年度に予定していたL11の機能解析を平成27年度に遂行する。平成26年度までに各生物界のL11相同体 (L11-like)、すなわち、真正細菌のE.coli (Ec_L11) とT. thermophilus (Tt_L11)、古細菌のP.horikoshii (Ph_aL11)、真核生物B.mori (Bm_eL12)のL11-like遺伝子を大腸菌L11のプロモーター制御下で発現誘導するプラスミドを構築することに成功している。平成27年度は、これらプラスミドを染色体上のL11遺伝子を破壊した大腸菌ΔL11株に導入し、それらのin vivoにおける生化学的特性を比較解析するとともに、各補填株からリボソームを抽出し、そのin vitro機能解析を進めることでGTPase翻訳因子受容に関わるL11の機能的分子機構を解明する。
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[Presentation] Biochemical Characterization of Stenopyche marmorata Silk Gland Proteins, Smsp-1 and Smsp-42014
Author(s)
Ohkawa, K., Nomura, T., Arai, R., Hirabayashi, K., Tsukada, M., and Abe, K.
Organizer
International Symposium on Fiber Science and Technology 2014 (ISF2014)
Place of Presentation
Tokyo Fashion Town (Koto-ku, Tokyo)
Year and Date
2014-09-28 – 2014-10-01
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[Presentation] Direct solubilization of phosphorylated proteins from larval adhesive net of caddisfly, Stenopsyche marmorata2014
Author(s)
Ohkawa, K., Nomura, T., Arai, R., Hirabayashi, K., Tsukada, M., and Abe, K.
Organizer
2nd International Conference on Biological and Biomimetic Adhesives (ICBBA2014)
Place of Presentation
Marmara University (Sultanahmet-Istanbul, Turkey)
Year and Date
2014-05-06 – 2014-05-09
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