非標準アミノ酸を利用した光開閉制御可能なバイオ・ナノカプセルの開発

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25870291
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 大野 敏 岐阜大学, 工学部, 助教 (10345796)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: タンパク質 / アミノアシルtRNA合成酵素 / 非標準アミノ酸 / カプセル

Research Abstract

平成２５年度は、粒子形成能を有するタンパク質（ルマジン合成酵素）を用いたバイオ・ナノカプセル発現系の構築と光異性化する非標準アミノ酸をタンパク質へ位置を指定して導入する技術の開発を主として進めた。
バイオ・ナノカプセル発現系の構築においては、先ず粒子形成能を有するタンパク質（ルマジン合成酵素）の性質を理解するために酵素単独の発現系を構築した。これをゲル濾過カラムクロマトグラフーにより分析を行ったところ、粒子形成されたと考えられる結果を得た。合わせて、内包するタンパク質単独の発現系の構築を行い、内包用蛍光タンパク質を得た。これを用いルマジン合成酵素カプセルへの内包を試みたところ、ゲル濾過カラムクロマトグラフーの結果から内包されていると考えられた。次年度ではカプセルと内包用タンパク質の発現を一つのプラスミドで可能となるように、プラスミドの再構築を予定する。
光異性化する非標準アミノ酸のタンパク質への導入法の構築に関しては、既存のガラクトシターゼを利用する選別系に加えて、蛍光タンパク質を利用する選別系の構築を行った。これは蛍光タンパク質遺伝子にアンバーコドンを導入し、アンバーコドンを非標準アミノ酸で読み過ごすことができれば蛍光タンパク質が発現し、それに伴い蛍光が観察されるという原理による。蛍光が観察される細胞はセルソーターを用いることで効率よく回収が可能となる。これら選別法を単独、および組み合わせることで効率の良い選別系を構築した。次年度は新たにランダム配列を含むaaRS遺伝子プールを作成し、アゾベンジルフェニルアラニンを基質とするaaRSを選別する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究項目として掲げた粒子形成能を有するタンパク質（ルマジン合成酵素）を用いたバイオ・ナノカプセル発現系の構築と光異性化する非標準アミノ酸をタンパク質へ位置を指定して導入する技術の開発については平成２５年度及び２６年度の２年間の計画としている。どちらの項目においてもその基礎となる部分を２５年度中に構築したことから順調に計画が進んでいると判断した。

Strategy for Future Research Activity

平成２６年度においては２５年度中に構築した選別系を利用し、アゾベンジルフェニルアラニンを基質とするaaRSを選別する予定である。選別系を組み合わせることでより良い酵素を選択することが可能と考えているが、最近アゾベンジルフェニルアラニンと類似の構造をもつ化合物を基質とする新たなaaRSを作成したとの報告があることから、この報告された酵素の発現系を構築し、本研究に用いることが出来るかの検討を合わせて行う予定である。