2013 Fiscal Year Research-status Report
生体適合性分子プローブを用いた生体組織修復および再生過程のイメージング
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25870359
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
木村 祐 京都大学, 健康長寿社会の総合医療開発ユニット, 特定准教授 (90566027)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 分子イメージング / 磁気共鳴イメージング / MRI / デンドリマー / ガドリニウム |
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| Research Abstract |
平成25年度では、(1) 細胞特異的に標識可能な新規高感度 Gd-MRI 造影剤の開発手法を明らかにすることを目的とし、研究代表者らのグループで開発した新規高感度磁気共鳴イメージング（MRI）造影剤に対して、標識分子を結合させるための官能基導入を実施した。加えて、末端チオール基を有する部分抗体（scFv）との反応条件検討および標識分子への結合能と MRI 造影剤としての機能の評価を行った。
具体的には、(1-1) マレイミド部位を有するキラルデンドリマートリアミン配位子の合成に成功した。(1-2) 還元処理を行った scFv との反応により、マトリクス支援レーザ脱離イオン化質量分析（MALDI-TOF MS）で 28,500 付近に明確な分子イオンピークを示す、キラルデンドリマートリアミン配位子（M+ = 1,180）- scFv（M+ = 27,415）複合体の合成に成功した。(1-3) 新規合成したキラルデンドリマートリアミン配位子-scFv 複合体をガドリニウムに配位させることで、最終的なGd-MRI 造影剤とすることに成功し、7T 小動物用 MRI 装置を用いた造影能評価の結果、臨床用造影剤（Gd-DTPA）よりも高いプロトン緩和能を有することを明らかにした。(1-4) 新規合成した scFv 導入キラルデンドリマートリアミン配位 Gd-MRI 造影剤について、水晶発振子マイクロバランス（QCM）法によって、抗原結合能が反応前後で変化しないことを確認した。これらの結果は今後の基質結合試験、細胞や動物を用いた実験に対しての道を拓くものであり、研究計画遂行において重要な進展であると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究代表者らのグループで開発した生体適合性新規高感度磁気共鳴イメージング（MRI）造影剤に対して、生体組織修復および再生に関わる細胞に特異的な抗体あるいはアプタマーを結合させて新規生体適合性分子プローブを合成し、これをモデル動物へ投与して経時的にMRI造影を行い、細胞の動態をリアルタイムで観察、生体組織の修復、および再生時における前駆・幹細胞の動態を明らかにすることが本研究の目的である。
平成25年度では、新規高感度Gd-MRI造影剤への官能基修飾と、生体組織修復および再生に関わる細胞（間葉系幹細胞や造血幹細胞）に特異的に結合する抗体やアプタマーの導入反応を検討した。具体的には、デンドリマー配位子に対するマレイミド部位の導入反応および、部分抗体（scFv）の還元による単量化反応と続く造影剤への結合反応、反応後の精製条件、最終的なガドリニウムイオンとの錯化反応の条件検討を行った。反応効率とその確認に関して種々問題が発生したが、平成25年度研究経費で購入したミニ恒温槽を用いて条件検討を行った結果、最適反応条件および結合反応の確認方法を見出した。また、抗原分子との結合定数測定についても、購入したQCM用分離セルを用いて種々の表面上での結合実験を行い、最終的に造影剤への結合前後で抗原結合能に差がみられないことを確認することができた。この反応条件は他の標的分子との結合反応に対しても適用可能であり、細胞特異的に標識可能な生体適合性分子プローブである新規高感度Gd-MRI造影剤の開発手法を明らかにすることができたことから、当初の計画通りおおむね順調に進展していると判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初計画のとおり、基質結合試験、細胞実験により、開発した生体適合性分子プローブの機能を明らかにする。
具体的には、細胞の表面に存在するタンパク質や糖鎖に特異的に結合する抗体やアプタマーを、縮合剤等を用いて造影剤に修飾した新規生体適合性分子プローブについて、間葉系幹細胞などとの相互作用を蛍光顕微鏡観察およびMRI 造影を用いて確認する。そののち、動物への投与を行い、MRI造影によって造影剤単体の体内動態、代謝挙動を明らかにする。加えて、上記細胞を足場材料（コラーゲンスポンジ）へ播種して動物へ局所移植し、新規造影剤を投与することで、動物内での造影剤と細胞の相互作用を確認する。
研究が当初計画通りに進まなかった場合には、既存手法との比較を行い新規抗体分子を探索するとともに、造影剤の修飾量変化や、表面の親水化などにより体内動態の最適化を行い、解決法を見出す。加えて、造影剤として広く用いられている酸化鉄ナノ粒子等、既存の材料も用いて解析を行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成25年度では、消耗品の購入に関して、当初計画よりも実験用プラスチック器具やガラス器具等の購入を行うことなく実験が進展したため次年度使用額が生じた.
平成26年度研究計画遂行のために必須である、新規Gd-MRI造影剤合成に必要な有機合成試薬およびガラス器具、細胞培養および動物実験に必要な試薬、プラスチック消耗の購入に用いるとともに、新規造影剤投与後の組織評価のため、標本作製を行う予定である。細胞および動物を用いた実験では、新規合成したGd-MRI造影剤がr大量に必要であり、次年度使用額はこの合成試薬購入に充当する。合成したGd-MRIの評価には実験動物を使用せざるを得ないため、この購入費用および維持費を計上している。また、研究遂行に際して分子イメージングおよび有機金属化学に関する研究実施者との議論ならびに資料収集を行なう必要があり、そのための旅費も計上している。
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