2013 Fiscal Year Research-status Report
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25870363
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
今城 正道 京都大学, 生命科学研究科, 助教 (00633934)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | Notch / EGF / noggin / 生体内遺伝子導入法 |
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| Research Abstract |
腸上皮幹細胞はクリプト底部において、幹細胞ニッチを供給するパネート細胞とモザイク状のパターンを形成する。これにより、幹細胞が生存と増殖に必要なシグナルを十分に受容することが可能となる。このモザイクパターンの形成と維持には幹細胞の移動が必要であり、本研究課題ではこの移動の制御機構を解明することを目標としている。平成25年度においては、実施計画に基づき、パネート細胞が供給する幹細胞移動の制御因子の同定を試みた。そのために、幹細胞特異的にEGFPを発現するLgr5-EGFPマウスからクリプトを単離し、in vitroクリプト培養法を用いて、幹細胞とパネート細胞のモザイクパターンに影響を与えるシグナル伝達因子を探索した。その結果、nogginやEGF量が過剰に存在すると、モザイクパターンの形成が抑制され、幹細胞同士が隣り合った領域が広くなることが分かった。また、notch経路の阻害剤の投与もモザイクパターンの形成を阻害した。nogginやEGF、notch経路のリガンドであるDll4はパネート細胞で特異的に発現し、幹細胞の維持に必要なニッチを形成している。上記の結果は、これらのニッチを形成する因子が幹細胞移動の制御にも重要な役割を果たしていることを示唆する。
これと並行して、幹細胞移動の制御機構をin vivoで解析するために必要な腸上皮への遺伝子導入法の開発を試みた。この方法では精製されたセンダイウイルスエンベロープにプラスミドやsiRNAを封入し、それを腸内腔へ投与することで、腸上皮特異的に封入された内容物を導入する。我々は、この方法によりクリプト底部に存在する幹細胞にも遺伝子を導入することが可能であることを見出している。今後は、クリプトのin vitro培養系とともに、この方法を用いて本研究課題を遂行していく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成25年度の研究計画では、パネート細胞から分泌され、幹細胞移動を制御するシグナル伝達因子の同定を最大の目標としていた。この点については、in vitroクリプト培養系を用いた実験から、noggin、EGF、notchリガンドの3つのシグナル伝達因子が重要であることが示唆された。今後、これらの因子がどのようにして協調的に幹細胞移動を制御するのか、またこれらの因子の下流で働く因子が何か解析することで、幹細胞移動の制御機構の一端が明らかになると考えられる。また、本研究課題を遂行するためにはin vitroクリプト培養法だけでは不十分であり、生体内で幹細胞移動の制御機構を研究する手法が必要であった。当初の研究計画では、これを達成するために、in vitroでクリプトを培養し、遺伝子導入を行った後に免疫不全マウスの腸へ移植する計画であった。しかしながらこの方法では、クリプトの定着効率が低いことや、一度の実験に長期間かかる（約一月程度）ことが欠点であった。これに対して、本年度に我々が開発した生体内遺伝子導入法は簡便に腸上皮への遺伝子を導入でき、一度の実験にかかる期間も4・5日程度と短いことが強みである。今後、クリプト移植法の代わりにこの方法を用いることで、当初の計画よりも迅速に、様々な遺伝子の幹細胞移動の制御における役割を解析できると考えられる。
以上のように、平成25年度においては、①幹細胞移動を制御する最上流のシグナル因子の同定と、②生体内で実験を行うための基盤技術の開発、という重要な2つの成果を挙げることが出来た。この二つの成果は、平成26年度以降の研究の基礎となるものであり、今後これをもとにして本研究課題を円滑に遂行することが出来ると考えている。従って、本年の研究目的の達成度は、「おおむね順調に進展している」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成25年度に得られた成果をもとに、今後は先ずnoggin、EGF、notchシグナルの下流でどのような因子が幹細胞移動の制御に関わるか調べる。これについては、in vitroクリプト培養法においてレンチウイルス等を用いて様々な遺伝子の過剰発現もしくは発現抑制を行い、幹細胞移動に与える影響を解析する。特にRhoファミリーGTPaseは様々な細胞の移動の制御に重要な役割を果たすことが知られており、これらの因子についてはFRETバイオセンサーを用いた活性の測定や、ドミナントネガティブ型変異体の発現による機能阻害実験等を通じて、幹細胞移動の制御における役割を調べる。これらの解析により、幹細胞移動を制御する因子が同定され、因子間の関係性も明らかになった場合には、その情報をもとに実験データを再現できる数理モデルの構築にも取り組む。また、生体における幹細胞移動の意義の解明にも取り組んでいく。これについては、平成25年度に開発した生体内遺伝子導入法を用いて、種々の因子が実際に生体内で腸上皮幹細胞移動の制御に関与しているか検討する。この解析により、個々の因子の幹細胞移動制御における役割が明らかになるだけでなく、腸上皮恒常性における幹細胞移動の意義も明らかになると考えられる。また、幹細胞移動は損傷を受けた組織の再生過程や腫瘍形成過程でも見られる現象であると考えられることから、これらの過程のモデルマウスを用いた実験にも取り組んでいく予定である。以上のように、今後はin vitroクリプト培養系と生体内遺伝子導入法を用いた実験をバランス良く組み合わせながら、幹細胞移動を制御する分子機構とその生体における意義の解明を目指して研究を遂行していく予定である。
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