2013 Fiscal Year Research-status Report
細菌が持つトキシン-アンチトキシン系の機能解析とその応用
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25870386
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
大塚 裕一 大阪大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (10548861)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | トキシン / アンチトキシン / 非コードRNA / 翻訳 / 大腸菌 / ファージ |
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| Research Abstract |
細菌が持つトキシン-アンチトキシン系（TAS）は、ストレス時に発現するトキシンが自身の増殖を停止させる仕組みである。本研究課題はトキシンが持つ毒性の分子機構とその活性制御機構を明らかにし、TASの生物学的役割をより明確にすることが目的である。本年度は、大腸菌O157株が持つTAS, z3289-sRNA1を研究対象として、sRNA1アンチトキシンによるz3289トキシンの翻訳抑制機構の解明を実施した。sRNA1アンチトキシンは非コードRNAであり、z3289 mRNAの翻訳開始領域の上流と20塩基の相補鎖を形成してトキシンの翻訳を抑制するが、その分子機構は不明である。今回、z3289 mRNAの翻訳開始領域の2次構造をソフトウェアを用いて予測し、塩基置換によるトキシンの発現と細胞増殖への影響を調べた。sRNA1がない場合、z3289は発現して毒性を発揮するが、sRNA1がある場合、z3289 mRNAと相補鎖を形成した結果、翻訳開始領域でステムループ構造が形成され、リボソームが結合できず、z3289の翻訳が抑制されることが明らかになった。この結果は、翻訳開始に必要でない領域での非コードRNAの結合が、翻訳開始領域の2次構造を変化させて遺伝子発現を抑制する新しい翻訳調節機構を示しており、近年研究が盛んな非コードRNAによる遺伝子発現制御の分野に新たな知見を加える重要な成果である。
異なる研究課題であるが、抗ファージ作用をもつK12株のTAS, rnlA-rnlBにおいて、ファージ感染によるRnlAトキシンの活性化に、DNA複製因子であるRNase HIが必須であることが分かった。この結果は、RNase HIの新たな機能、さらにはトキシンを直接活性化する因子という点において、新規の発見である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題は４つの研究項目からなるが、その中の１つ、「sRNA1アンチトキシンによるz3289の翻訳抑制機構の解明」に関しては、制御の分子機構がほぼ明らかになり、現在論文として発表するための再確認の実験を行っている。よって、この研究項目は当初の計画以上に進展している。また今年度実施を計画していた研究項目「z3289トキシンの発現から増殖停止の原因である活性酸素の発生までの機構の解明」と「トキシンペプチドによる抗菌効果の検討」に関しては、予定していたほど実験は進んでなく、現在のところ期待していた成果はまだ得られていない。従って今年度は総合的に見ると、概ね順調に進展していると判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
「sRNA1アンチトキシンによるz3289の翻訳抑制機構の解明」に関しては、全体像が見えてきたので、論文として発表するための基礎的データ（RNAの２次構造と蛋白質発現量の確認）をとり、次年度中の論文発表を目指す。また今年度あまり進展しなかった「z3289による毒性の分子機構の解明」に関しては、次年度集中的に研究を進める。具体的には、以下の3つの研究項目を実施する。
1. 膜ストレス応答と増殖阻害の関係：z3289トキシンは膜ストレス応答を誘導して増殖阻害を引き起こす。私は、膜ストレス応答により発現が増加する遺伝子の中に、ストレス適応遺伝子だけでなく、増殖阻害を誘導する遺伝子も含まれているのではないかと考えている。そこで、z3289により発現量が増加する遺伝子を次世代シークエンサーを用いて同定する。次にその中から膜ストレス応答や増殖阻害の原因である活性酸素の発生に関連する遺伝子を探索し、z3289による増殖阻害の分子機構に迫る。
2. z3289トキシンによる活性酸素の発生機構：z3289は活性酸素の発生に必要な2価鉄イオンと過酸化水素の細胞内濃度を何らかの機構で上昇させていると考えられる。そこで、細胞内への鉄の取り込みや過酸化水素の発生にかかわる因子の変異株を用いて、その分子機構を明らかにする。
3. z3289トキシンの局在と膜の脱分極の関係：z3289は内膜に局在して膜を脱分極する。そこでイオンチャネルの変異株やチャネル阻害剤を用いて、z3289発現時の増殖能と蛍光試薬DiBAC4で膜の脱分極の程度を観察する。またz3289蛋白質が小孔を形成することで膜を脱分極する可能性も検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
今年度は、計画していたマイクロアレイ実験が、試料調整の問題や研究代表者の所属先の変更のために、実施できなかった。また時間的な余裕がなく、国内や海外での学会や研究会に参加できなかった。
主として研究の遂行に必要な試薬、抗体作成、消耗品に使用する。また次年度は、当初予定していたマイクロアレイ実験ではなく、次世代シークエンサーを用いた遺伝子発現解析を計画している。その他は、国内外での学会や研究会への旅費と論文発表のための費用として使用する。
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