2014 Fiscal Year Research-status Report
SEREX法を応用したハイリスク甲状腺腫瘍の血清学的スクリーニング法の開発
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25870440
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
伊澤 正一郎 鳥取大学, 医学部附属病院, 助教 (30572599)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 抗WDR1抗体価 / SEREX / 甲状腺乳頭癌 / 甲状腺未分化癌 / ELISA / エピトープマッピング / 血清診断 / スクリーニング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 抗WDR1抗体価の甲状腺癌血清診断マーカーとしての確立
甲状腺癌の患者血清中に存在すると考えられる抗WDR1抗体について、WDR1のC末端側に存在すると予想されるエピトープを同定するため、Clinical Endocrinology (2013) 79, 35-42においてクローニングした領域をGST結合蛋白を含まない蛋白として合成することを目指した。既報にて用いた蛋白のGSTタグを切断したり、Hisタグを用いた合成系を検討したが、いずれの大腸菌を用いた発現系においてもごく少量の合成は可能であるものの2量体もしくは3量体を形成して不安定となった。また固相化も極めて困難となった。そこでWDR1の2次元構造あるいは3次元構造から改めて検討したところ、WDR1は疎水性領域に富み、特に大腸菌を用いた発現系ではinclusion bodyを形成し易い性質があることがわかった。このようなペプチドに対して酵母を用いた発現系が有効であることが報告されていることから、酵母を用いた系にてGST結合WDR1の発現を試みたが、大腸菌を用いた系と同様の結果であった。
以上の結果より、WDR1抗体のエピトープ決定においてWDR1全長あるいは高分子量のペプチドを用いたELISA測定系の確立は困難と判断した。現在、WDR1の全長をカバーする100ペプチドからなるペプチドライブラリーを作成し、各ペプチドと患者血清の反応性を検討するエピトープマッピングを進行中である。
2. StageⅠの甲状腺乳頭癌スクリーニングに優れた新規診断マーカーの同定
昨年度実施した甲状腺乳頭癌3例の原発巣と正常甲状腺を用いた発現アレイの結果を用いて、クラスタリング解析やgene ontology解析を実施し、新規診断マーカーの絞り込みを行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
1. 抗WDR1抗体価の甲状腺癌血清診断マーカーとしての確立
当初、Clinical Endocrinology (2013) 79, 35-42においてクローニングした領域のGSTタグを切断したり、Hisタグを用いた合成系を検討したが、いずれにおいても安定した大量の抗原の合成、ELISA系における固相化は困難であると判断した。そこで新たな手法としてWDR1全長をカバーする12アミノ酸からなるペプチドのライブラリーを作成し、エピトープマッピングにて検討する方針とした。安定した測定系の確立が完了していないため、当初予定していた多数患者での検討への移行が困難となった。
2. StageⅠの甲状腺乳頭癌スクリーニングに優れた新規診断マーカーの同定
クラスタリング解析やgene ontology解析を実施し、新規診断マーカーの絞り込みを行い、WDR1と同様の手法で検討することを目指した。しかしWDR1で経験された問題から、GST結合蛋白など大腸菌や酵母を用いた系で研究を進めるのか、あるいはペプチド合成を応用するのかのできていないため、WDR1で進行中の知見を元に進める方針とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 抗WDR1抗体価の甲状腺癌血清診断マーカーとしての確立
ペプチドライブラリーと甲状腺癌および良性疾患の患者血清を用いたエピトープマッピングにより、候補となる抗原決定部位が絞り込まれると考えられる。至適条件を検討の上で、多数患者による検討を行う。複数の抗原決定基が同定された場合は、それら複数を用いたELISA測定系を検討する。また抗原決定部位がWDR1の3次元構造を反映した不連続であった場合には、再度3次元構造解析を検討する。
2. StageⅠの甲状腺乳頭癌スクリーニングに優れた新規診断マーカーの同定
抗WDR1抗体のエピトープ決定の経過を踏まえ、クラスタリング解析やgene ontology解析で得られた知見を元に、患者血清とリコンビナント蛋白あるいはペプチドライブラリーの反応性を検討する。
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| Causes of Carryover |
当初実施予定であった多数患者における抗WDR1抗体価の測定が、安定した測定系の確立が困難であったことから実施できなかった。そのため、測定に用いる予定であった人件費・謝金の支出が発生しなかった。
また、ペプチド合成にて作成したWDR1全長を網羅するペプチドライブラリーを用いたELISA系の検討を開始したものの、測定が平成26年度中に終了できなかったため平成26年度の支出が予定を下回ることとなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ペプチド合成にて作成したWDR1全長を網羅するペプチドライブラリーを用いたELISA系の確立を早急に実施し、多数患者での測定及び臨床指標（甲状腺機能、甲状腺自己抗体価、血清サイログロブリン値、腫瘍径、甲状腺推定重量、予後等）との対比を進める。
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