脂肪由来間葉系幹細胞のサイトカイン機能解析と効率的な脳梗塞再生治療法の開発

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25870502
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 古田 興之介 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (60546571)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 脂肪由来間葉系幹細胞 / 脳梗塞再生医療

Outline of Annual Research Achievements

(1)マウスの脳梗塞モデルの確立
20-25gの雄マウスを2％イソフルレンで吸入麻酔し、マウスを腹臥位にして頭蓋骨を露出。レーザードップラー血流計(FLO-C1、OMEGAWAVE社製)の血流測定用プローブを中大脳動脈(MCA)支配領域に接着剤にて固定。次にマウスを仰臥位として、前頸部を正中切開し、頸動脈を露出。右総頚動脈を一時的に遮断し右外頸動脈(ECA)を結紮の上切開し、silicon coated monofilaments(602056PK10、栓子径200μm、全長20㎜、Doccol社製)を挿入。右内頚動脈の末梢側へとすすめ、右MCAを閉塞。MCA閉塞はレーザードップラー血流計で血流振動の低下によって確認した。MCA閉塞から2時間後に再度麻酔下に再開創し、filamantを除去して急性期脳梗塞(MCA2時間閉塞)モデルを作成した。梗塞巣の評価には、2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)染色を用いた。脳梗塞作成から24時間後に磯古錬吸入にて深麻酔後に頸椎脱臼で安楽死させ、脳を切り出してマウス用のブレインスライサーにて1㎜間隔の冠状断の脳切片を作成、1％TTC溶液中に37℃、20分間静置する。染色された脳標本をデジタルカメラにて撮影し、画像処理ソフトウェアを用いて梗塞体積を評価した。以上の手技を熟練した。

(2)脂肪由来間葉系幹細胞(AD-MSC)の分離培養
正常マウスを安楽死後にアルコール消毒し腹部切開。両祖型上部の脂肪を切り出した。洗浄、破砕後に酵素処理を行い、600G、5分間室温で遠心分離した。脂肪成分、上清を除去して間質細胞群を得た。さらにマイクロフィルター濾過と遠心分離を繰り返して脂肪由来の幹細胞群を得た。これを細胞培養して間葉系幹細胞と思われる細胞群(AD-MSC)を得た。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

マウスでは手技が細かく、脳梗塞作成が均一にならずに脳梗塞マウスが死亡することが多かった。このため手技に十分に習熟する時間が必要であった。
研究代表者の勤務先や所属変更など、研究環境の変化のためエフォートが著しく低下した。
また使用していたパソコンが壊れ、データ破損した。

Strategy for Future Research Activity

(理由)
研究の遅れにより、試薬などの購入を控えたため、次年度に持ち越すこととなった。

(使用計画)
平成27年4月より他大学職員に復帰したため、エフォート向上が確実となった。手技的な問題は解決しているので、研究環境を再構築でき次第、研究をすすめる。

Causes of Carryover

主に研究代表者の研究環境が変化したことから研究の遅れが生じた。そのため試薬などの購入を控えたため、次年度に持ち越すこととなった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成27年4月より大学職員に復帰したため、エフォート向上が確実となった。これを受け、これまでの遅れを取り戻すべく、当初の予定通りに試薬等を購入し研究を進める方針である。