脂肪由来間葉系幹細胞のサイトカイン機能解析と効率的な脳梗塞再生治療法の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25870502
• Research Institution: Kochi University
• Principal Investigator: 古田 興之介 高知大学, 医学部附属病院, 特任講師 (60546571)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 脂肪由来間葉系幹細胞 / 脳梗塞再生医療

Outline of Annual Research Achievements

(1)マウスの脳梗塞モデルの確立
20-25gの雄マウスを2%イソフルレンで吸入麻酔し、マウスを腹臥位にして頭蓋骨を露出。レーザードップラー血流計(FLO-C1、OMEGAWAVE社製)の血流測定用プローブを右中大脳動脈(MCA)支配領域に接着剤にて固定。次にマウスを仰臥位として、前頸部を正中切開し、頸動脈を露出。右総頸動脈を一時的に遮断し右外頸動脈(ECA)を結紮の上切開し、silicon coated monofilaments (602056PK10、栓子径200μm、全長20mm、Doccol社製) を挿入。右内頸動脈の末梢側へと進め、右MCAを閉塞。MCA閉塞はレーザードップラー血流計での血流信号の低下によって確認した。MCA閉塞から2時間後に再度麻酔下に再開創しfilamentを除去して急性期脳梗塞（MCA 2時間閉塞）モデルを作成した。梗塞巣の評価には、2,3,5-triphenyltetrazolium chloreide (TTC)染色を用いた。脳梗塞作成から24時間後にイソフルレン吸入にて深麻酔後に頸椎脱臼で安楽死させ、脳を切り出し、マウス用のブレインスライサーにて1mm間隔の冠状断の脳切片を作成、1% TTC溶液中に37℃、20分間静置する。染色された脳標本をデジタルカメラにて撮影し、画像処理ソフトウエアを用いて梗塞体積を評価した。以上の手技を熟練した。

(2)脂肪由来間葉系幹細胞(AD-MSC)の分離培養
正常マウスを安楽死後にアルコールに浸し、腹部切開し、両鼠径上部の脂肪を切り出した。洗浄、破砕後に酵素処理を行い、600Ｇ、5分間室温で遠心分離した。脂肪成分、上清を除去して間質細胞群を得た。さらにマイクロフィルター濾過と遠心分離を繰り返して脂肪由来の間質細胞群を得た。これを培養して間葉系幹細胞と思われる細胞群(AD-MSC)を得た。
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Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

マウスでは手技が細かく、脳梗塞作成が均一にならずに脳梗塞マウスが死亡することが多かった。このため、手技に十分に習熟する時間を要した。
使用していたパソコンのHDDが壊れデータ破損した。
研究代表者の勤務先が変更となり、研究用の顕微鏡ほか器材を整備する費用が必要となった。
さらに救急部所属となったこと、救急部医師不足により救急患者診療の負担が増えたため、研究時間が著しく削減された。

Strategy for Future Research Activity

平成28年6月より救急部医師増員のため、研究代表者への負担が軽減することとなり研究時間の確保が可能となる予定である。

Causes of Carryover

主に研究代表者の研究環境が変化したことから研究の遅れが生じた。具体的には平成27年4月より救急部所属となり、さらに救急部他医師の突然の退職に伴い、研究代表者への臨床実務負担が増えた結果、研究時間が著しく削減された。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成28年6月から救急部医師増員予定のため、研究時間確保が可能となる予定である。これまでの遅れを取り戻すべく、必要物品を購入し研究を進める方針である。